НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 4, с. 300-306
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 546.100.02.3:547.15/17
ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛИГАНД-РЕЦЕПТОРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГАМК НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ НЕРВНЫХ КЛЕТОК
© 2014 г. Т. В. Вьюнова*, Л. А. Андреева, К. В. Шевченко, В. П. Шевченко, Н. Ф. Мясоедов
ФГБУН Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва
Работа посвящена исследованию роли пептидных анксиолитиков (селанка и его короткого фрагмента — Аг§-Рго-О1у-Рго) в возникновении прямых и опосредованных изменений основных параметров специфических лиганд-рецепторных взаимодействий у-аминомасляной кислоты (ГАМК) на плазматических мембранах нервных клеток мозга. Установлено, что в присутствии исследуемых пептидов изменяется количество специфически связанного лиганда — [3Н]ГАМК. Предварительное интраназальное введение селанка также вызывает изменения в количестве мест специфического связывания [3Н]ГАМК, но не влияет на аффинность рецепторов. Более сложные отставленные во времени эффекты вызывает предварительное интраназальное введение Аг§-Рго-О1у-Рго (ИРОР). Полученные в работе данные свидетельствуют и о влиянии пептидов на клеточные регуляторные механизмы, не связанные с лиганд-рецепторным взаимодействием исследуемых пептидов в местах их воздействия. Таким образом, биологическое действие селанка может быть обусловлено сочетанием прямого модулирующего действия пептида на рецепторы-мишени и запуском биохимических клеточных механизмов, определяющих молекулярные основы физиологического действия пептида.
Ключевые слова: ГАМК, регуляторные пептиды, селанк, специфическое связывание, аллостерическая модуляция, радиолиганд, нейрорецепторы, протеолиз, плазматические мембраны, аффинность, пептидные анксиолитики, интраназальное введение.
Б01: 10.7868/81027813314040116
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в качестве основных возбуждающей и тормозящей нейросистем человека рассматривают, в первую очередь, глутамат- и ГАМК-ергическую соответственно. Нарушение баланса активности указанных систем приводит к развитию серьезных патологических сдвигов в нормальной работе центральной нервной системы (ЦНС), в частности — к возникновению или обострению нейродегенеративных заболеваний, формированию фобий, эпилепсии, шизофрении [1—3]. Около 40% нейронов ЦНС являются ГАМК-ергическими [4]. Как эндогенный агонист, ГАМК снимает возбуждение и оказывает успокаивающее действие, обладает легким гипотензивным действием, незначительно снижает частоту сердечных сокращений, оказывает умеренное ан-тигипоксическое и противосудорожное действие [5, 6]. Как ноотропное средство, повышает продуктивность мышления, улучшает память, благоприятно влияет на восстановление движений и речи после нарушения мозгового кровообраще-
* Адресат для корреспонденции: 123182, Москва, пл. Курчатова, 2, факс (495)196-02-16, e-mail: p2@list.ru.
ния [7]. Подтипы рецепторов ГАМК найдены в различных отделах головного мозга, показано их участие в образовании синаптических контактов [8—10], в управлении ионными каналами [11, 12]. Непрерывно растет число обнаруженных и синтезированных соединений — аллостерических модуляторов работы ГАМКА-рецепторов, при этом молекулярный механизм действия таких молекул на ГАМК-ергическую систему до конца не выяснен [13—15]. Одними из наиболее исследованных аллостерических модуляторов ГАМКа-рецепторов являются бензодиазепины, различные синтетические модификации которых нашли широкое применение в медицинской практике. Однако им присущи известные недостатки, прежде всего — седативное и миорелаксантное действие, развитие толерантности и привыкания при длительном приеме, синдром отмены [16, 17]. О белковых и пептидных регуляторах функционирования ГАМК-рецепторов известно довольно немного [18, 19]. В основном действие обнаруженных молекул опосредовано сторонними механизмами, не относящимися к прямому взаимодействию с ГАМК-рецепторами [20—23]. Одним из вероятных пептидных модуляторов работы
ГАМК-рецепторов является гептапептид — се-ланк, характеризуемый по фармакологической активности как нетипичный анксиолитик [24]. По спектру психотропной активности селанк принципиально отличается от типичных бензо-диазепиновых анксиолитиков отсутствием седа-тивного, гипнотического и миорелаксантного действия [25], а также наличием ноотропного эффекта. С высокой долей вероятности, другим потенциально активным регулятором работы ГАМК-рецепторов может оказаться и более короткий пептид ЯРОР, представляющий собой С-концевой фрагмент молекулы селанка и также обладающий психотропной активностью. О том, что продукты протеолиза регуляторных пептидов могут обладать собственной биологической активностью, способны специфически взаимодействовать на плазматических мембранах клеток-мишеней [26], а в ряде случаев, и конкурировать с молекулой-предшественником за места связывания, было показано ранее на примере семакса и его синактона [27]. Выяснение молекулярных основ влияния селанка и его короткого производного (тетрапептида ЯРОР) на параметры специфических взаимодействий эндогенного лиганда (ГАМК) с собственными рецепторами, а также анализ отставленных во времени изменений в специфическом связывании, обусловленных предварительным интраназальным введением пептидов лабораторным животным, стало основной задачей данного исследования.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на самцах крыс линии Вистар массой 180—220 г, которых содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму ad libitum, по пять особей в клетке в течение 1-й недели до начала эксперимента, на стандартной диете при 12-часовом световом режиме. Для изучения рецепторного связывания исследуемых фармакологически важных пептидов был синтезирован лиганд ГАМК-рецепторов [3Н]ГАМК с удельной радиоактивностью 52 Ки/ммоль и радиохимической чистотой не менее 95%.
Реактивы: CaCl2 (Fluka); Tris (tris(hydroxymeth-yl)aminomethane) — BioRad Laboratories (США); BSA, EDTA, Benzamidine, PepstatinA, Bacitracin, фенилметилсульфонилфторид (PMSF) — Tocris (США); фосфатно-солевой буфер — ПанЭко (Россия).
Буферы: буфер А (10 мМ Трис-НС1, рН 7.4 при 4°C, 0.32 М сахароза, 1 мМ EDTA, 1 мМ бензами-дин , 0.1 мМ PMSF); буфер А2 (10 мМ Трис-HCl, рН 7.4 при 4°C, 0.22 М сахароза); буфер Б (50 мМ Трис-НС1, 1 мМ CaCl2, 0.003% BSA, рН 7.4 при 30°C).
При работе использовали дозаторы и пластиковую посуду Eppendorf. Радиорецепторный анализ проводили на специальной установке (MultiScreen System, Millipor, США) с использованием 96-луночных планшетов с GF/B фильтрами (Willson, США).
Выделение мембран проводили при 4°С. Взрослых крыс линии Вистар декапитировали, извлеченный головной мозг промывали холодным фосфатно-солевым буфером, переносили в буфер А, где разделяли на соответствующие отделы (кора, гиппокамп и т.д.). Полученные образцы гомогенизировали в 10 объемах буфера А в гомогенизаторе тефлон-стекло. Гомогенат центрифугировали в течение 20 мин при 1000 g, осадок отбрасывали, а супернатант подвергали повторному центрифугированию при 40000 g в течение 30 мин. Плотный коричневый осадок на дне пробирки, обогащенный митохондриями, отбрасывали, а менее плотный светлый осадок мембран суспендировали в буфере А, переносили в чистую пробирку и промывали этим же буфером, осаждая мембраны центрифугированием, аналогичным предыдущему. По окончании промывок осадок суспендировали в буфере А2, разделяли на порции и замораживали в жидком азоте (хранили не более 30 сут при —70°С). Концентрацию белка в образцах мембран определяли по методу Харт-ри-Лоури.
Радиолиганд-рецепторный анализ. Инкубирование реакционной смеси осуществляли непосредственно в лунках стандартных 96-луночных планшетов с GF/B фильтрами. Реакционная смесь (конечный объем 200 мкл) содержала: 50 мкл раствора радиоактивно меченого лиганда, 50 мкл буфера (либо немеченого лиганда, либо исследуемого соединения — в зависимости от конкретного эксперимента), реакцию начинали добавлением 100 мкл раствора мембранного белка (конечной концентрации в инкубационной смеси 0.2 мг/мл), разведенного в буфере Б с добавлением комбинации ингибиторов (100 мкМ PMSF + 10 мкМ Bacitracine + 5 мкМ Pepstatine А). Планшеты выдерживали при температуре 30°С и постоянном перемешивании в течение 20 мин. По окончании инкубации пробы фильтровали непосредственно через планшетные фильтры, трижды промывали холодным буфером Б по 200 мкл. Планшет сушили на воздухе, затем фильтры отделяли и переносили в сцинтилляци-онные флаконы, содержащие 4 мл сцинтилляци-онной смеси.
Для определения радиоактивности использовали сцинтилляционную смесь Liquid Scintillator Unisolve 100 (KOCH-Light Ltd., Suffolk, Англия), измерения проводили на приборе Tri-carb 2100R Liquid Scintillation Analyser (Packard BioScience Comp., США). Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием программы Sigma Plot (SPSS Inc., США).
50
40 -
30 -
20
10 -
0
140 120 100 80 60 40
20
40 б
60
80
100
20
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Рис. 1. Специфическое связывание [3Н]ГАМК на плазматических мембранах коры головного мозга крысы.
По горизонтальной оси отложена концентрация радиоактивно меченного лиганда, нмоль. По вертикальной оси отложено количество мест специфического связывания [3Н]ГАМК, пмоль/мг белка мембран. На графике 1а показан участок, соответствующий высокоаффинному центру связывания [3Н]ГАМК (К<л). График 1 б соответствует участку, характеризующему менее аффинный центр специфического связывания [3Н]ГАМК (Кй2) - область высоких концентраций лиганда.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В условиях, оптимальных для инкубирования пептидных молекул (обеспечен низкий уровень деградации пептидов, снижено число неспецифических взаимодействий и т.п.), на плазматических мембранах коры головного мозга крысы было показано существование двух центров специфического связывания [3Н]ГАМК (рис. 1), характеризуемых константами связывания Ки = 15 нМ и Кй2 = = 81 нМ, максимальным числом мест специфического связывания Втах1 = 40 пмоль/мг белка мембран и Втах2 = 109 пмоль/мг белка мембран соответственно.
Различные структуры го
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.