БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1998, том 24, № 9, с. 696-709
УДК 577.113.6
ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И ИХ ФОСФОНАТНЫЕ АНАЛОГИ: СИНТЕЗ И ГИБРИДИЗАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА
© 1998 г. В. А. Ефимов#, А. А. Бурякова, М. В. Чуб, О. Г. Чахмахчева
Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16110 Поступила в редакцию 27.02.98 г. Принята к печати 03.04.98 г.
Описан синтез ряда ДНК-миметиков, представляющих собой пептидо-нуклеиновые кислоты, фос-фонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот и их гибриды. Разработаны препаративные методы получения соответствующих мономеров и методики автоматического твердофазного синтеза олигомеров-миметиков. Получены модификации фосфонатных аналогов пептидо-нуклеиновых кислот, в частности хиральные производные и производные с дополнительными гидроксильными группами в боковых цепях остова, а также пиренсодержащие производные пептидо-нуклеиновых кислот и их фосфонатных аналогов. Исследована способность полученных олигомеров специфически гибридизоваться с комплементарными цепями ДНК и РНК. Показано, что фосфонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот и их гибриды с пентидо-нуклеиновыми кислотами способны образовывать комплексы с комплементарными фрагментами ДНК и РНК, причем стабильность комплексов увеличивается пропорционально увеличению количества остатков пептидо-нуклеиновых кислот в цепи миметика. Последнее свойство наряду с хорошей растворимостью в воде создает предпосылки для дальнейшего их изучения как потенциальных антисенс- и антигенных реагентов.
Ключевые слова: олигонуклеотиды; ДНК-миметики; пептидо-нуклеиновые кислоты; фосфонатные аналоги; гибриды; комплексообразование.
За последние 20 лет синтетические олигонуклеотиды уверенно вошли в практику как уникальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии и биотехнологии. Они широко применяются при выделении генов из природных источников и определении их первичной структуры, в качестве зондов и праймеров, как специфические мутагены в белковой и генетической инженерии, а также в качестве строительного материала при получении искусственных генов и регуляторных фрагментов нуклеиновых кислот. Одной из сфер применения синтетических олигонуклеотидов и в особенности их аналогов является использование в качестве специфических ингибиторов экспрессии генов и репликации вирусов, что создало предпосылки для разработки на их основе лекарственных средств нового поколения. С этой целью было предложено внушительное число аналогов нуклеиновых кислот [1], в том числе новый класс соединений, известный как пептидные или полиамидные аналоги нуклеиновых кислот (ПНК) [2].
Сокращения: ПНК - пептидо-нуклеиновые кислоты; фПНК - фосфонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот; DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ен; TPS-NT -2,4,6-триизопропилбензолсульфонил-З-нитро-1,2,4-триазо-лид; FPLC - быстрая жидкостная хроматография, ММТг -4-монометокситритил; DMTr - 4,4'-диметокситритил.
#Автор для переписки (e-mail: eva@ibch.siobc.ras.ru).
Классический вариант ПНК состоит из ахи-ральных мономерных субъединиц, полученных на основе /У-(2-аминоэтил)глицина, несущего в виде боковых цепей гетероциклические основания НК (рис. 1). Ввиду высокой аффинности к ДНК и РНК, а также устойчивости к деградации внутриклеточными протеиназами, эти соединения привлекли внимание исследователей как потенциальные субстанции для терапевтического использования. Однако биологическое применение ПНК ограничивается их плохой растворимостью в воде, склонностью к самоагрегации, неспособностью активировать РНКазу Н и плохим проникновением сквозь клеточные мембраны [3, 4]. При физиологических значениях рН молекулы ПНК не заряжены, что, с одной стороны, приводит к их плохой растворимости в воде, а с другой -усиливает их необычные гибридизационные свойства. Был предпринят ряд попыток улучшить растворимость ПНК, в том числе за счет получения гибридов ПНК-ДНК [4-8]. Было показано, что подобные химеры специфически гибридизу-ются с НК, однако ввиду сильного различия структур ДНК и ПНК стабильность комплексов, образованных ПНК-ДНК-гибридами с НК, сильно зависит от количества, состава и взаимного расположения остатков нуклеотидов и мономеров ПНК в цепи гибридного олигомера.
Ш
О
N
НЫ
,0
N
О
,0
ни
\
Г1НК
/
о
о
N
"О'
-Л)
о
о
N
"О"
шч
о
N
С
-о-}
нч
-О
о
N
"О / ш
-О
о
о
N
С -0-/ ш
-О
о
N
"О-
ю
\
фПНК-0 фПНК--¥ фПНК-МЭ
(фосфоноэфирный тип) (фосфонамидный тип) (смешанный тип)
Ш
О
N
"О'
-О
О
о
М'
ны
о
N
-О'
--0
о
ш
о
N
/
ны
-.о
о
N
О
но\г
о
N
/
НИ
ю
ПНК-фПНК-а
(гибриды с чередующимися мономерами)
" Ш
ПНК-фПНК-я
(гибриды с чередующимися сегментами)
Рис. 1. Структуры ДНК-миметиков: пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК), фосфонатных аналогов пептидо-нуклеино-вых кислот (фПНК) и их гибридов различного типа.
Недавно в качестве альтернативных соединений, которые были бы лишены этих недостатков, был предложен новый класс ДНК-мимети-ков, представляющий собой фосфонатные аналоги ПНК (фПНК) (рис. 1) [9-12]. Эти молекулы построены на основе Л'-(2-гидроксиэтил)- или Л/-(2-аминоэтил)фосфоноглицина, несущего пири-мидиновые и пуриновые основания в виде боковых цепей. Предварительное изучение свойств фПНК олигомеров показало, что они полностью устойчи-
вы к гидролизу эндо- и экзонуклеазами, а наличие отрицательных зарядов в их остове способствует прекрасной растворимости в воде. Кроме того, эти молекулы способны специфически гибридизовать-ся с комплементарными последовательностями НК, хотя температуры плавления образующихся при этом комплексов ниже, чем у подобных комплексов, образованных ПНК-олигомерами [12].
Поскольку молекулы ПНК и фПНК - изосте-ры, логическим продолжением этих исследова-
16 14 12
я
ю 5
о
8 <и
С£ Ж
6 ° и ^
ж
4 £ <и а. ? CQ
Рис. 2. Сравнение выходов димеров и скорости образования фосфонодиэфирной связи при взаимодействии фПНК-моиомера (V6), содержа[цего различные фосфонатзащитные группы: 4-нитрофенилэтильную (/), фенильную (2), 2-метилфенильную (S) и мономера (1X6) (4, 3), с ОН-компонентом (VI6) (1-4) или ЫН2-компонентом (Via) (5). Реакции проводились в ацетонитриле с использованием 0.025 М растворов мономеров и 0.03 М раствора TPS-NT в присутствии 4-метоксипиридин-А'-оксида (0.06 М) (7-i) или пиридина (20%) (4, 5).
нии стал синтез химерных олигомеров, содержащих мономеры обоих типов [12, 13]. Нами были получены такие химеры, состоящие либо из чередующихся сегментов, содержащих по нескольку мономерных остатков ПНК или фПНК, либо из чередующихся мономеров ПНК и фПНК, и включающие все четыре гетероциклических основания ДНК [12]. Было показано, что химеры ПНК-фПНК обладают свойствами, сочетающими высокие гибридизационные характеристики ПНК с хорошей растворимостью в воде фПНК, и, таким образом, улучшают характеристики обоих этих аналогов ДНК [12, 13].
Настоящее сообщение посвящено синтезу ряда новых вариантов молекул фПНК, а также усовершенствованию методологии препаративного синтеза соединений, используемых для получения олигомеров ПНК, фПНК и их гибридов, и дальнейшему изучению свойств этих ДНК-миметиков.
ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ МОНОМЕРНЫХ СИНТОНОВ ДЛЯ СИНТЕЗА фПНК-ОЛИГОМЕРОВ
Для создания фосфонодиэфирной связи между фПНК-мономерами нами была выбрана хорошо разработанная методология фосфотриэфир-ного синтеза ДНК [14, 15]. Подход к получению фПНК-мономеров, содержащих защитные группы, совместимые с этим методом синтеза, был основан на получении универсального промежуточного соединения (III), представляющего со-
бой О- и /'-защищенный /У-(гидроксиэтил)- или N- и Р-защищенный УУ-(аминоэтил)аминометил-фосфонат, к которому в качестве боковой цепи может быть присоединено любое гетероциклическое основание.
Ключевой стадией в синтезе этого интермедиа-та является образование системы связей P-C-N-H с помощью реакции Кабачника-Филдса между диалкил- или диарилфосфитом и иминным производным (II), предварительно полученным конденсацией формальдегида с 1-(0-диметокситритил)-2-аминоэтанолом (16) или ^-(монометокситри-тил)этилендиамином (1а) (схема 1). Дальнейшее ацилирование интермедиата (III) бромуксусным ангидридом в присутствии- /V-метилморфолина с последующим присоединением гетероциклического основания давало полностью блокированный мономер (IV), селективное удаление с которого одной из Р-защитных групп приводило к получению моноэфира фосфоната (V), представляющего собой Р-компонент, аналогичный Р-компоненту для триэфирного синтеза олиго-нуклеотидов. В то же время удаление тритильной защитной группы с соединения (IV) давало возможность получить гидроксильный (или амино-) компонент (VI) для проведения последующей реакции конденсации между двумя мономерными производными в растворе. В качестве Р-защит-ных групп нами были опробованы как ароматические (фенильная, 2-метилфенильная), так и ал-кильные (2-цианэтильная и 4-нитрофенилэтиль-ная [11, 16]) группы.
Сравнение эффективности образования фос-фонодиэфиров из полученных нами мономеров (V), содержащих различные фосфонатные защитные группы, проводилось на примере реакции конденсации их с гидроксильным компонентом (VI6) с образованием димера (Хб) в растворе в присутствии конденсирующего реагента, в качестве которого использовался TPS-NT (рис. 2). Реакция проводилась в ацетонитриле в присутствии 4-метоксипиридин-Л/-оксида в качестве нук-леофильного катализатора [14]. При этом в случае соединений, имеющих фенильные защитные группы, уже за 1-2 мин наблюдалось образование фосфонодиэфира (Хб) с выходами до 95%, тогда как мономеры, имеющие алкильные Р-защитные группы, реагировали гораздо медленнее, давая через 15 мин выходы не более 50% и значительное количество побочных продуктов вследствие протекания побочной реакции сульфонилирова-ния при взаимодействии конденсирующего реагента с компонентом (VI6).
Исследование устойчивости соединений (VI), имеющих различные Р-защитные группировки показало, что при действии оснований (в частности, пиридина или триэтиламина) на мономер, содержащий Р-фенильную защитную группу, в з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.