ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 177-183
УДК 576.526
ПЕПТИДОСОДЕРЖАЩАЯ ФРАКЦИЯ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ Fusarium sambucinum: СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
© 2014 г. В. В. Богданов*, Э. Ф. Фаткулина*, Б. Б. Березин*, А. П. Ильина*, В. П. Ямскова**, И. А. Ямсков*
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: larina@ineos.ac.ru **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334
e-mail: idbras@bk.ru; Поступила в редакцию 3.06.2013 г.
Культуральную жидкость гриба Fusarium sambucinum исследовали на содержание в ней новой группы пептидосодержащих биорегуляторов, ранее обнаруженных в различных тканях млекопитающих и растений. Выделена фракция, содержащая пептиды с молекулярной массой от 1000 до 2000 Да, которая проявляла специфическую мембранотропную активность, а также ряд физико-химических свойств, характерных для биорегуляторов данной группы. Впервые изучено действие данной фракции на модели роллерного органотипического культивирования ткани печени тритона Pleurodeles waltl in vitro, которое выражалось в дополнительной активации пигментированных клеток печени тритона — аналогов купферовских клеток печени млекопитающих, а также в поддержании адгезионных межклеточных взаимодействий в ткани. Полученные результаты показывают, что в культуральной среде гриба F. sambucinum присутствуют пептидосодержащие биорегуляторы новой группы.
DOI: 10.7868/S0555109914020068
В последнее время грибы привлекают к себе внимание исследователей как источники новых биологически активных веществ [1]. Одним из перспективных объектов изучения является мицелий гриба Fusarium sambucinum, который относится к роду анаморфных плесневых грибов. Данный род широко распространен в природе, является фитопатогеном. Штаммы F. sambucinum наносят вред сельскому хозяйству, вызывая заболевания как у растений (фузариозы), так и у животных и людей (фузариотоксикозы). Такие свойства представителей рода Fusarium указывают на способность этих организмов вырабатывать большое количество различных биологически активных веществ. Известно, что грибы продуцируют антибиотики, ауксины, гиббереллины и витамины [1], тем не менее, поиск новых биологически активных веществ, синтезируемых грибами, и в том числе предствителями рода Fusarium, является актуальной задачей прикладной биохимии.
Работа посвящена исследованию новой группы биорегуляторов в культуральной среде гриба рода Fusarium, которые были ранее обнаружены практически во всех тканях животных: млекопитающих, птиц, амфибий, а также в растениях [3— 6]. В работе предполагалось проверить, прежде всего, наличие этих веществ у представителей царства грибов. Эти биологически активные вещества были выделены в отдельную группу на основании общности проявляемых физико-хими-
ческих свойств и биологического действия, они получили название мембранотропных гомеоста-тических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ). Было установлено, что МГТБ локализованы в межклеточном пространстве тканей, способны в очень низких дозах влиять на важнейшие биологические процессы (адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку клеток, биосинтез и т.д.), стимулируют восстановительные и репаративные процессы в патологически измененных тканях. Активность МГТБ характеризуются отсутствием видовой специфичности, но наличием тканевой [3—6].
Изучение биорегуляторов данной группы показало, что они проявляют ряд оригинальных физико-химических свойств: в растворах присутствуют в виде крупных наноразмерных частиц, а их вторичная структура характеризуется преимущественным содержанием ß-структур и статистического клубка [7]. Ранее полученные результаты указывают на сложный состав МГТБ: они включают в себя белковую, углеводную, а также липидную компоненты, причем в состав белковой компоненты входят как небольшие пептиды (мол. масса не более 6 кДа), которые ответственны за биологическое действие, так и белки, модулирующие активность последних (белки-модуляторы) [8].
Цель работы — обнаружение биорегуляторов данной группы в культуральной жидкости гриба Fusarium sambucinum, что включало получение
фракции, содержащей биорегуляторы данной группы, изучение ее состава и физико-химических свойств, специфического биологического действия фракций, содержащих МГТБ, на модели роллерного органотипического культивирования ткани печени тритонов Pleurodeles waltl.
МЕТОДИКА
Выделение фракции МГТБ из культуральной жидкости среды Г. ъатЪпстит. Биорегуляторы выделяли из культуральной жидкости F. sambuci-num, штамм 2682, первоначально выделенного из верхнего почвенного горизонта (ельник-зелено-мошник) в Волоколамском районе Московской области. Штамм хранился во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером F-3051D.
Штамм ВКМ F-3051D гриба выращивали методом глубинного культивирования в качалочных колбах на питательной среде следующего соста-ва(г/л): меласса — 20; глицерин — 2.0; нитрат аммония — 3.5; магния сульфат — 0.2; калия хлорид — 0.3; фосфат натрия однозамещенный — 0.8; кобальта хлорид — 0.2, при температуре 26—28°С на качалке (240 об/мин) в течение 18 ч. Затем культу-ральную жидкость центрифугировали и далее использовали для выделения биорегулятора [2]. Для этого к 3 л фильтрата культуральной жидкости добавляли 2350 г (до насыщения) сухого сульфата аммония, тщательно перемешивали, не допуская пенообразования. Полученную смесь оставляли на 7 сут при 4°С, далее центрифугировали (15000 §, 20 мин, 4°С), собирали надосадочную жидкость (супернатант). Осадок, представляющий собой черную маслянистую субстанцию, далее не исследовали. Супернатант длительно диализовали против дистиллированной воды через целлюлозную диализную пленку до полного удаления ионов аммония, которое контролировали при помощи реактива Несслера. Супернатант концентрировали на вакуумном роторном испарителе до объема 450 мл. Данную фракцию разделяли методом ВЭЖХ и исследовали физико-химическими методами, а также на проявление мембранотроп-ной активности.
Обращенно-фазовую ВЭЖХ супернатанта (50 мл фракции) проводили на хроматографе высокого давления "Милихром" (Россия), используя гидрофобную колонку "Кгоша8П" С8 той же фирмы. В качестве элюента использовали раствор вода—ацетонитрил с возрастающей концентрацией последнего от 5 до 80% с добавлением 0.1% трифторуксусной кислоты (ТФУ). Скорость элюции 0.6 мл/мин. Во фракциях определяли оптическую плотность при 280 нм. Объединенные фракции помещали в термостат (37°С, 24 ч) для удаления ацетонитрила и исследовали физико-
химическими методами, а также — на наличие мембранотропной активности.
Концентрацию белка определяли на спектрофотометре "Carl Zeiss" (Германия), по разнице оптической плотности (D) растворов при 260 и 280 нм.
Физико-химические свойства фракций, содержащих МГТБ. Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области (от 195 до 260 нм) снимали на КД-спектрометре "Jasco" (Япония) при 20°С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Были изучены супернатант и его фракции, полученные после проведения ВЭЖХ, в виде водных растворов. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных 3 сканирований и вычитания спектра базовой линии (контроля).
Определение размеров частиц в растворах биологически активных фракций осуществляли методом лазерного динамического светорассеяния на приборе "Zetasizer Nano" фирмы "Malvern" (Германия). Непосредственно перед помещением исследуемого раствора в кювету его пропускали через мембранные фильтры "Millipore" (США) с размером пор 0.22 мкм. Обсчет полученных данных проводили с помощью встроенной в прибор программы Zetasizer v. 7.01.
Супернатант, а также 1—3 фракции, полученные при ВЭЖХ, были исследованы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Образцы упаривали досуха с последующим разведением в растворе 70%-ного ацетонитрила с 0.1%-ной ТФУ. В качестве матрицы использовали 2-циано-4-гид-роксикоричную кислоту. Анализ молекулярной массы белков проводили на масс-спектрометре "Ultra flex 2 MALDI" фирмы "Bruker" (Германия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в прямом пролете.
Оценка мембранотропной активности фракций.
Первый адгезиометрический метод. Эксперименты проводили на кратковременных множественных органных культурах печени мыши in vitro. В опытах использовали мышей — гибридов C57Bl/CBA F1 (20—22 г обоего пола), содержавшихся в виварии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН в стандартных условиях. После декапитации животного из печени вырезали фрагменты размером примерно 1 мм3 массой от 0.7 до 2 мг и помещали во флаконы с культуральной жидкостью. В контрольной серии в каждый пенициллиновый флакон, содержащий по 1 мл среды Хенкса 199, помещали по 5 фрагментов ткани. Во флаконы опытной серии, содержащие по 1 мл раствора исследуемой фракции в различных концентрациях, также помещали по 5 фрагментов ткани печени. Растворы получали последовательным 10-кратным разбавлением (в 10, 100, 1000 и т.д. раз) исследуемых фракций в 199 среде с исходной концентрацией 0.1 мг/мл.
Для этого отбирали 0.1 мл исходной фракции, добавляли 0.9 мл среды 199 и интенсивно встряхивали 10—15 раз. Из полученного раствора 0.1 мл, переносили в другой пенициллиновый флакон и добавляли 0.9 мл питательной среды и интенсивно встряхивали. Эту процедуру проводили до разбавления исследуемой фракции в 1015 раз. Таким образом, получали ряд флаконов с растворами биорегулятора в среде 199 с концентрациями, от 10-1 до 10-15 мг белка/мл. Первые два раствора, соответствующие 10- и 100-кратному разбавлению исходной фракции, не исследовали из-за влияния воды, привнесенной вместе с исследуемым раствором, на плотность и состав питательной среды, что могло повлиять на результаты эксперимента.
Фрагменты ткани печени инкубировали в течение 120 мин при 37°С. Затем каждый фрагмент как в контрольной, так и опытной серий, извлекали из флаконов, сушили, взвешивали с точностью до 0.1 мг и диспергировали в 0.1 мл 0.1%-ного раствора трипанового синего, приготовленного на среде 199, используя стеклянный дезинтегратор с зазором 50 мкм [3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.