БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 544 - 555
УДК 577.4
ПЕРЕХОДНЫЕ СОСТОЯНИЯ ЛЕГГЕМОГЛОБИНА И ДРУГИХ ГЕМОПРОТЕИНОВ ПРИ ИХ ДЕНАТУРАЦИИ
© 2015 Пиджуш Басак1, Нилой Кунду2, Рудрадип Паттанаяк1, Майтри Бхаттачария1*
1 Университет Калькутты, кафедра биохимии, Индия, 700019 Колката; факс: +91(33)246-14849, электронная почта: bmaitree@gmail.com 2 Индийский институт технологий, химический факультет, Индия, 721302 Харагпур; факс: +91(32)22-282252
Поступила в редакцию 25.09.14 После доработки 20.11.14
Проведено исследование переходных состояний при развертывании мономерных белков леггемоглобина, миоглобина и цитохрома с с помощью спектрофотометрии в УФ-видимой области спектра, измерения стационарной флуоресценции и флуоресценции с разрешенным временем. Конформационная стабильность нативного «свернутого» состояния белков и их «развернутых» состояний были исследованы с точки зрения модели двух переходных состояний. Значения AGD (298° ф при двух переходных состояниях получены при денатурации хаотропными агентами (мочевиной и гуанидин-гидрохлоридом, Gdn-HQ). Значения свободной энергии леггемоглобина во время денатурации было ниже в сравнении с цитохромом с и миоглобином. Значение т было наименьшим для леггемоглобина, в сравнении с цитохромом с и миоглобином. Значение т (мера зависимости AGD от концентрации денатурирующего агента) для цитохрома с и миоглобина ниже, чем в случае денатурации мочевиной по сравнению с гуанидин-гидрохлоридом. Максимум поглощения в УФ-видимой области спектра и максимумы эмиссии флуоресценции в стационарном состоянии резко сдвигались в красную область в присутствии определенных концентраций, как в случае миоглобина, так и леггемоглобина, однако в случае цитохрома с картина была иной. Полученные данные были проанализированы с использованием модели двух переходных состояний. Данные по продолжительности жизни указывают на наличие промежуточного состояния во время денатурации. Развертывание белков может модулировать конформацию, стабильность и расположение на поверхности этих биологически активных белков.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: денатурация, гемопротеин, свободная энергия Гиббса, переходные состояния, хаотроп-ный агент.
Высокая чувствительность остатка триптофана к его микроокружению является ценным свойством внутренней флуоресценции белков. Конформационные переходы, ассоциации субъединиц, связывание лигандов или денатурация и др. приводят к изменениям спектра эмиссии триптофана. Эти взаимодействия могут воздействовать на локальное окружение вокруг ин-дольного кольца. По-видимому, только остаток триптофана чувствителен к тушению в результате столкновений из-за тенденции возбужденного состояния индольного кольца к донации электрона.
Развертывание белковой молекулы может быть вызвано экстремальными значениями температуры, pH, высокими концентрациями хао-тропных агентов и высоких значений давления. Более того, ограниченные конформационные
* Адресат для корреспонденции.
изменения во время развертывания могут сопровождать связывание специфических лигандов с белком. Глобальное разворачивание белка из упорядоченного нативного состояния (N, обладающее узким диапазоном микросостояний) к неупорядоченному развернутому состоянию (U, обладающее широким диапазоном микросостояний и возможно приближающееся в определенных условиях к случайному flight coil), может дать основную термодинамическую характеристику стабильности белка. Изменение свободной энергии для перехода N о Uявляет-ся основным термодинамическим параметром, который обеспечивает меру стабильности состояния N относительности состояния U. Несколько экспериментальных методов могут быть использованы для прослеживания за переходом в развернутое состояние, и флуоресцентная спектроскопия является одним из наиболее полезных и многосторонних методов. В этой связи
представляют большой интерес денатурирующие агенты, воздействующие на вторичную и третичную структуру без влияния на первичную структуру. Наиболее часто для этих целей используются мочевина и гуанидин-гидрохлорид. Из-за высокого сродства к пептидным связям эти молекулы разрушают водородные связи и солевые мостики между положительно и отрицательно заряженными боковыми цепями аминокислотных остатков, нарушая третичную структуру пептидной цепи. При удалении денатурирующих агентов из раствора белка во многих случаях происходит восстановление натив-ной формы белка. Денатурация разрушает а-спи-рали и в-складчатые структуры белков с образованием структур со случайной формой [1]. Обычно во время денатурации происходит осаждение или коагуляция белков, приводящие к образованию биологически неактивной молекулы [2].
Леггемоглобин (Lb—leghemoglobin) — это мономерный гемопротеин, структурно схожий с миоглобином, но при этом обладающий в десять раз большим сродством к кислороду. Легге-моглобин транспортирует кислород от мембраны центральных клеток клубня бобовых к сим-биосомам, которые представляют собой мемб-рано-связанные внутриклеточные органеллы, в которых расположены бактериоиды — внутриклеточные азотфиксирующие формы бактерий рода Ш^оЫшт [3]. Было обнаружено, что цито-хром с, небольшой гем-содержащий белок, являющийся ключевым компонентом электрон-транспортной цепи, относительно слабо связан с внутренней мембраной митохондрий. Он способен подвергаться окислению и восстановлению, но при этом не связывает кислород. Ци-тохром с является высококонсервативным белком и встречается во многих видах растений, животных и одноклеточных организмах. Прос-тетическая группа гема в цитохроме с прикреплена к глобиновой цепи посредством ковалент-ной связи. В этом случае связывание молекулы порфирина является более прочным по сравнению с миоглобином и леггемоглобином. Мио-глобин связывает ионы железа и кислород и, в основном, обнаруживается в мышечной ткани у позвоночных и почти у всех млекопитающих. Этот белок состоит из восьми а-спиралей и гидрофобного ядра, но не демонстрирует кооперативный характер связывания кислорода, как это делает гемоглобин. В миоглобине имеется проксимальный остаток гистидина, прикрепленный непосредственно к центральному атому железа, и дистальный остаток гистидина, расположенный на противоположном конце и не прикрепленный к атому железа. Таким образом, эти бел-
ки различаются по их биологическим функциям, несмотря на то, что все они содержат гем и обладают определенным сходством первичной структуры.
Наша работа посвящена изучению профиля денатурации этих трех гемопротеинов с использованием двух денатурирующих агентов, мочевины и гуанидин-гидрохлорида, для сравнения их поведения под воздействием хаотропных агентов. Были проведены измерения оптического поглощения и снижения стационарной и разрешенной во времени флуоресценции для исследования переходных состояний образующихся при развертывании этих гемопротеинов [4-5].
Динамика белка и его конформация изменяются в ответ на изменения его окружения. Если микроокружение белка оказывает воздействие на силы взаимодействия, такие как Ван-дер-Ва-альсовы силы, водородные, ионные и ковалент-ные связи, которые удерживают молекулу белка в определенной нативной конформации, то молекула белка может подвергнуться разворачиванию в результате разрушения этих связей. Хао-тропные агенты, такие как мочевина и гуанидин-гидрохлорид (Gdn-HCl), являются органическими веществами, которые способны индуцировать разворачивание вследствие возрастания растворимости неполярных остатков белков [6]. Хотя механизм денатурации в результате использования этих агентов не совсем ясен, предполагается, что эти вещества взаимодействуют с пептидным остовом и разрушают водородные связи. Известно, что мочевина и Gdn-HCl различаются между собой: мочевина имеет нейтральный заряд и способна проникать в гидрофобные участки в белках, вызывая сольватацию неполярных групп, которые, как правило, не контактируют с растворителями. Молекула Gdn-HCl обладает положительным зарядом и в значительной степени влияет на ионную силу и pH раствора. Принято считать, что Gdn-HCl лучше подходит для разрушения поверхностных взаимодействий гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, увеличивая общую растворимость белка [7].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Приготовление образцов белков. Миоглобин и цитохром с были приобретены в «Sigma» (США). Леггемоглобин был выделен и очищен из корневых клубеньков Arachis hypogea согласно методу, описанному Басаком с соавт. [8].
Измерение оптического поглощения. Измерения стационарного оптического поглощения
нативного белка и денатурированного белка после двухчасовой инкубации осуществляли на двулучевом спектрофотометре Jasco V630.
Измерения стационарной флуоресценции. Изучение разворачивания проводили с использованием мочевины или Gdn-HCl. Белки инкубировали в присутствии различных концентраций денатурирующего вещества в течение 2 ч. Образцы белков возбуждали при длине волны 295 нм, при ширине волны 5 нм и измерения флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi F7000.
Большинство процессов денатурации протекает через двухэтапные механизмы. Кажущаяся константа равновесия KD между денатурированным и нативным состоянием может быть подсчитана по следующей формуле [4]:
Kd = F - Fn/(FD - F), (1)
где F — это наблюдаемая интенсивность флуоресценции, FN и Fd — величины интенсивности флуоресценции нативного и денатурированного белка соответственно.
Значения AGD, кажущейся свободной энергии процесса денатурации, получали по следующей формуле:
AGD = — RT ln KD. (2)
Простой метод измерения конформацион-ной стабильности в отсутствие денатурирующих агентов tAGDH20 основан на предположении, что линейная зависимость продолжается до нулевой концентрации и использовании метода наименьших квадратов для того, чтобы вставить полученные данные в следующее уравнение:
AGd = AGd,h20 — m[D], (3)
где m — мера зависимости AGD от концентрации денатурирующего вещества, AGDH20 — свободная энергия процесса разворачивания в отсутствие денатурирующего вещества, [D] — концентрация денатурирующего вещества.
Путем продолжения линейной вариации AGD с [D] до нулевой концентрации денатурирующего веществ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.