ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2015, том 49, № 1, с. 26-31
= ФОТОХИМИЯ
УДК 535.37:577.345:544.77:544.723.2:577.322.7
ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ МЕЖДУ МОЛЕКУЛАМИ ЦИАНИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ В КОМПЛЕКСЕ С БЕЛКОМ И В СИСТЕМАХ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ С БЕЛКОВЫМИ ПОКРЫТИЯМИ
© 2015 г. П. Г. Пронкин, О. Н. Сорокина, А. В. Бычкова, М. Н. Колганова, А. Л. Коварский,
М. А. Розенфельд, А. С. Татиколов
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, 4
Е-таИ: pronkinp@gmail.com Поступила в редакцию 12.05.2014 г. В окончательном виде 03.07.2014 г.
Исследован перенос энергии электронного возбуждения (ПЭЭВ) между молекулами карбоцианино-вых красителей, нековалентно связанных с сывороточным альбумином человека (САЧ). В качестве донора энергии электронного возбуждения использовался 3,3'-ди-(гамма-сульфопропил)-9-метил-карбоцианин-бетаин (Д) и в роли красителя-акцептора 3,3'-ди-(гамма-сульфопропил)-4,5,4',5'-ди-бензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаин (А). ПЭЭВ был изучен как в образцах, представляющих собой растворы САЧ, так и в системах, содержащих магнитные наночастицы (МНЧ) с белковыми покрытиями. Устойчивые покрытия МНЧ из смеси САЧ и сывороточного альбумина быка (БСА) сформированы способом свободнорадикального сшивания молекул белков, адсорбированных на поверхности частиц. Изучено влияние денатурации САЧ на спектрально-флуоресцентные свойства красителей и ПЭЭВ, получены данные по тушению флуоресценции донора акцептором. Сделаны выводы о сохранении САЧ функциональных свойств в составе сшитого покрытия, что свидетельствует в пользу биосовместимости покрытий, полученных свободнорадикальной окислительной модификацией белка.
БОТ: 10.7868/8002311971501010Х
Процессы переноса энергии электронного возбуждения привлекают пристальное внимание исследователей, прежде всего благодаря высокой чувствительности флуоресцентных аналитических методик и возможности определять пространственное расположение донорных и акцепторных групп, в качестве которых могут выступать части биологических молекул, лиганды, клеточные рецепторы. Все это делает эксперименты по ПЭЭВ особенно интересными для изучения строения и взаимодействий, протекающих в биологических и искусственных системах. В частности, ПЭЭВ позволяет получить информацию о локализации и взаимодействии молекул флуоресцентных зондов с белками [1, 2].
В настоящей работе спектрально-флуоресцентными методами изучен ПЭЭВ в донорно-ак-цепторных парах тиакарбоцианиновых красителей, нековалентно связанных в комплекс с САЧ в образцах двух типов. Первый тип образцов представлял собой растворы белка в фосфатном буфере; при этом в ряде образцов САЧ подвергался денатурации под действием мочевины. Известно, что денатурация белков изменяет их функциональные свойства [3], что может влиять на взаи-
модействие белка и красителей-зондов. Нами ставилась задача показать возможность использования красителей-зондов (в том числе, при ПЭЭВ) для оценки степени денатурации САЧ в растворе.
Второй тип образцов представлял собой дисперсии наноразмерных частиц магнетита со смешанными покрытиями из БСА и САЧ. МНЧ с покрытиями на основе белковых молекул представляются перспективными для применения в биомедицине [4—7] благодаря биосовместимости белковых покрытий [4, 8]. Создание покрытий из САЧ и БСА — первый шаг к получению функциональных многокомпонентных покрытий на МНЧ. Для закрепления покрытий из САЧ и БСА использован свободнорадикальный способ сшивания белков, основанный на свойстве белков формировать межцепочечные ковалентные связи под действием свободных радикалов, в генерации которых участвуют ионы железа на поверхности наночастиц. Этот способ использовали при получении однокомпонентных покрытий из БСА, иммуноглобулина О, тромбина [9—12]. Следует отметить, что адсорбция белков на поверхности наночастиц и протекание в таких системах сво-боднорадикальных процессов могут приводить к
изменению конформации макромолекул и утрате их функций (денатурация белков) [13, 14]. В данной работе применен ПЭЭВ для оценки сохранения природных функциональных свойств САЧ в системах, содержащих наночастицы магнетита с белковыми покрытиями.
В качестве донора (Д) энергии электронного возбуждения выбран краситель 3,3'-ди-(у-суль-фопропил)-9 - метилтиакар боцианин - б етаин, в качестве акцептора (А) использован краситель 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этил-тиакарбоцианин-бетаин.
N+
CH3
R
Д R
N / R
(CH2)sSO3-
А Я = (СН2)^03
Взаимодействие этих красителей с различными сывороточными альбуминами исследовано в [15—17]; показано, что красители образуют прочные комплексы с высокими константами связывания, при этом происходит пространственная фиксация фрагментов молекул, взаимодействие с белками сопровождается сдвигом цис-транс-рав-новесия и резким ростом квантового выхода флуоресценции.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Спектры поглощения красителей измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (Россия), флуоресцентные измерения — на спектрофлуориметре "Флуорат-02-Панорама" (Россия) в стандартных 1 см кварцевых кюветах. Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции корректировались на спектральную характеристику прибора (сигнал опорного канала) и на сигнал пропускания образца.
Использовали красители Д и А (см. выше), предоставленные проф. Б.И. Шапиро (НИИХИМ-ФОТОПРОЕКТ). В качестве растворителя использовались дистиллированная вода и фосфатный буфер с рН 6.5. Растворы красителей готовили непосредственно перед проведением измерений. Для определения квантовых выходов флуоресценции акцептора, связанного с САЧ, пользовались данными [15].
Сравнительная оценка степени взаимодействия красителей и САЧ выполнялась в терминах
эффективной концентрации белка (ceff, %), равной отношению интенсивностей флуоресценции комплекса краситель—САЧ в исследуемом образце и в контрольном растворе белка.
МНЧ были синтезированы методом соосажде-ния солей двух- и трехвалентного железа в водной среде в присутствии гидроксида аммония с последующей электростатической стабилизацией в фосфат-цитратном буфере с pH 4.0. Для создания покрытий применялся новый способ свободно-радикального сшивания белков на поверхности наночастиц [10, 11]. Для контроля размеров частиц использовался метод динамического светорассеяния (ДРС), измерения выполняли на приборе "Zetasizer Nano-S" ("Malvern", Англия) без дополнительного разбавления образцов. Для удаления из раствора белка, не связанного в составе покрытия, использовалась магнитная сепарация [10]. Контроль устойчивости покрытий на МНЧ проводился по конкурентному замещению альбумина фибриногеном [10].
При синтезе МНЧ и получении покрытий применяли: 7-водный сульфат железа(П), 6-водный хлорид железа(Ш) (х.ч., "Вектон", Россия), гид-роксид аммония (ос.ч., "Химмед", Россия), натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-вод-ный (ч.д.а.), натрий фосфорнокислый двузаме-щенный 12-водный (х.ч., "Химмед", Россия), лимонную кислоту одноводную (ос.ч., "Реахим", Россия), 3% пероксид водорода (медицинский препарат, Россия), САЧ и БСА, фибриноген человека ("Sigma-Aldrich", США). Для денатурации белка использовалась кристаллическая мочевина (х.ч., "Химмед", Россия).
Эффективность (r) процесса ПЭЭВ между молекулами красителей (донора и акцептора) определялась, исходя из спектров по уравнению (1):
r =
'ex. Д
/1 ex. А
Absд/ AbsA
(1)
где /ех.д, IexA, ЛЬяд и AbsA — интенсивности полос донора (Д) и акцептора (A) в спектрах возбуждения флуоресценции (Iex) и поглощения (Abs) [18].
Критический радиус переноса энергии (R0) определен исходя из теории Фёрстера [18, 19]:
R = 0.2108(к2Фf0njF(X)s(X)X4^)1/6, (2)
где к2 — ориентационный фактор, зависящий от взаимной ориентации моментов перехода донора и акцептора; Ф/0 — квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора; n — показатель преломления среды; F(k) — нормализованный спектр флуоресценции донора; s(X) — молярный коэффициент поглощения акцептора, л моль-1 см-1; X — длина волны, нм. В выражении (2) к2 = 2/3, что соответствует беспорядочной взаимной ориента-
S.
S
I, отн. ед.
X, нм X, нм
Рис. 1. Спектры поглощения (а) и флуоресценции при Хех = 530 нм (б) красителей Д и А (сд = 2.0 х 10 6 моль л 1, сСАЧ = 1.49 х 10-5 моль л-1), при сА = 0 (1), 6.0 х 10-7 (2), 1.56 х 10-6 (3), 2.3 х 10-6 (4) моль л-1; на вставке: спектры возбуждения флуоресценции красителя Д при Са = 1.56 х 10-6 моль л-1 Хд = 610 (1') и 640 нм (2').
ции флуорофоров. Расстояние (Я) между донором и акцептором определялось по выражению [18]:
г = е06/($6 + я6). (3)
Тушение флуоресценции донора при введении в систему акцептора описывается уравнением Штерна-Фольмера [18]:
Л,/1 = 1 + К(4) где 10 и I - интенсивности (квантовые выходы) флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя соответственно, [0] - концентрация тушителя, К8У - константа тушения Штерна-Фольмера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При отсутствии взаимодействия с белком ПЭЭВ между красителями в гомогенном растворе не происходит, что обусловлено большими расстояниями между молекулами донора и акцептора (в растворе при концентрациях красителей ~2.0 х 10-6 моль л-1 составляет 500 А). В образце, содержащем раствор 1 мг/мл САЧ (сСАЧ = 1.49 х 10-5 моль л-1) в фосфатном буфере (рис. 1), в спектрах возбуждения флуоресценции А (Хя = 612 нм) наблюдается полоса Д
(X™х ~ 565 нм), что обусловлено ПЭЭВ (рис. 1, кривая 2').
Исходя из теории Фёрстера [18, 19], определены характеристики ПЭЭВ. Для красителей Д и А при концентрации САЧ 0.45 мг/мл (сСАЧ = 6.7 х х 10-6 моль л-1) значение эффективности г = = 0.6. Увеличение концентрации белка снижает
эффективность ПЭЭВ до 0.37 при сСАЧ = 1.49 х х 10-5 моль л-1 (при сА = 1.95 х 10-6 моль л-1). Увеличение концентрации акцептора в образце увеличивает эффективность ПЭЭВ, что связано с ростом доли молекул акцептора, связанных в комплекс с САЧ. Эффективность ПЭЭВ г достигает 0.54 при сА = 2.9 х 10-6 моль л-1 и сСАЧ = 1.49 х х 10~5 моль л-1. В выбранном промежутке концентраций САЧ значения Я0 (выражение (2)) лежат в пределах 51-54 А; при увеличении концентрации САЧ Я0 незначительно увеличивается. Соответс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.