МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1076-1084
ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.122.8
ПЕРЕНОС ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА A-I ЧЕЛОВЕКА МЫШАМ МЕТОДОМ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИХ ИНЪЕКЦИЙ: ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА В ПЕЧЕНИ ЖИВОТНОГО
© 2004 г. Б. Н. Акифьев1, Э. Б. Диже1, А. М. Ефремов2, Д. А. Могиленко12, Г. Н. Олейникова1, И. А. Лапиков1,2 , О. Ю. Жданова1 , О. В. Кидготко1, С. В. Орлов1,2, А. П. Перевозчиков1,2
1НИИ экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург, 197376 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, 199034
Поступила в редакцию 22.03.2004 г.
Ген аполипопротеина A-I (apoA-I) человека в составе плазмидных векторов экспрессии переносили in vivo мышам линии C57B1/6 с помощью метода гидродинамических инъекций в хвостовую вену. Использовали плазмидные векторы экспрессии apoA-I двух видов: 1) pCMVcapoAI - кДНК apoA-I под контролем промотора CMV; 2) pAlg - геномный локус, в котором интронированный ген apoA-I находится под контролем собственной протяженной 5'-регуляторной области (APOAI). Гидродинамические внутривенные инъекции плазмид обоих типов приводят к появлению в клетках печени мышей мРНК apoA-I человека, в крови животных - белка человека ApoA-I. Динамика содержания ApoA-I человека в сыворотке крови мышей, инъицированных указанными плазмидами, различна. В случае pCMVcapoAI - ApoA-I человека выявляется на следующий день после инъекции в максимальном количестве, затем его содержание к концу второй недели спадает до нуля. В случае pAlg - содержание ApoA-I человека достигает максимальных значений на 5-7 сут (в отдельных случаях до концентрации 20 мкг/мл в сыворотке) и в дальнейшем медленно спадает в течение месяцев (в контролируемом случае через полгода это количество составляло 25% от максимального значения). Опыты по "спасению" pAlg, выделенной (спустя 50 сут после инъекции) из ядер клеток печени, свидетельствуют о том, что плазмида длительно сохраняется в эписомном виде. Значительный уровень ApoA-I человека в сыворотке и его длительное поддержание после инъекции мышам pAlg могут объясняться свойствами 5'-регуляторной области (APOAI) или(и) экзонно-ин-тронной структуры гена apoA-I. Поскольку инъекции мышам различных вариантов APOAI, сцепленных с геном люциферазы, не приводят к длительному сохранению активности люциферазы в печени, делается вывод, что наличие интронов в структуре гена apoA-I необходимо для эффективной и продолжительной его работы после доставки мышам методом гидродинамических инъекций.
Ключевые слова: мыши C57B1/6, внутривенные гидродинамические инъекции, плазмидные векторы экспрессии гена аполипопротеина A-I человека, генотерапия, значение экзонно-интронной структуры гена для длительной экспрессии in vivo.
HYDRODYNAMICS-BASED TRANSFER OF HUMAN APOLIPOPROTEIN A-I GENE INTO MICE: STUDY OF FACTORS INVOLVING AN EFFICACY AND DURATION OF THE TRANSFERRED GENE EXPRESSION IN ANIMALS' LIVER, by B.N. Akifiev1,E.B. Dizhe1, A.M. Efremov2,D. A.Mogilenko12, G.N. Olejnikova1,
7 9 7 7 79 Pi i j '
I. A. Lapikov1,2, O. Yu. Zhdanova1, O. V. Kidgotko1, S. V. Orlov1,2, A. P. Perevozchikov1,2 (1Institute of Experimental Medicine, Russian Academy of Medical Science, St.Petersburg, 197376 Russia; E-mail: aap@iem.sp.ru; 2St. Petersburg State University, 199034). Human apolipoprotein A-I gene (apoA-I) plasmid expression vectors were transferred into mice by hydrodynamic injections into tail vein. Two types of expression vectors were used. First one -pCMVcapoAI contains cDNA of apo A-I driven by human cytomegalovirus early gene promoter (CMV). Second one - pAlg contains genomic locus of intron-containing apo A-I under control of own extended 5'-regulatory region (APOAI). Hydrodynamic intravenous injections of both expression vectors led to appearance of human apo A-I mR-NA in the liver and human Apo A-I protein in the serum of injected mice. Dynamics of human Apo A-I content in the serum of mice injected by pCMVcapoAI and pAlg were different. When pCMVcapoAI was used, maximal concentration of human Apo A-I protein in the mouse serum was detected one day after injection with following decline to zero level during next two weeks. Under the same conditions injections of pAlg led to maximal level of human Apo A-I concentration in the mouse serum (up to 20 mkg/ml in some animals) on the 5th-7th day of experiment with following graduate decline during several months (human Apo A-I concentration in the serum of oldest analyzed mouse (6 months after injection) was about 25% of its maximal level in the same animal). Levels of human Apo A-I concentration in the mouse serum were compatible after injections of both expression vectors, in spite of much more strong activity of CMV promoter in comparison with APOAI in cultured human hepatoma cells HepG2. We ascribe the revealed difference in dynamics of human Apo A-I expression to delay of apo A-I transcription from pAlg vector,
*Эл. почта: aap@iem.sp.ru
that was confirmed by nested RT-PCR. Significant level and long-term persistence of human Apo A-I in the serum of mice injected by pAlg could be explained by properties of APOAI or (and) exon-intron structure of genomic apo A-I gene. To test the role of APOAI in long-term expression of human Apo A-I in the mice we performed hydrody-namic injections of plasmid vectors containing cDNA of reporter gene encoding luciferase driven by variants of APOAI. No long-term expression of luciferase was found in the livers of injected mice. Therefore, our data suggest the role of exon-intron structure in maintaining of efficient and long-term expression of transferred human apo A-I.
Методы генотерапии различных заболеваний получают в последнее время все более широкое распространение [1]. Наиболее важный момент -доставка пациентам гена, продукт экспрессии которого оказывает терапевтическое воздействие. При этом весьма существенными являются и способы доставки вектора экспрессии гена в организм, и подбор регуляторных участков, определяющих уровень и продолжительность активности этого гена в организме.
Несмотря на то, что процедура доставки генов в составе рекомбинантных вирусов (аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ретровирусов и др.) под контролем вирусоспецифических регуляторных областей (например, промотора ранних генов цитомегаловируса человека - СМУ), в силу своей высокой эффективности, наиболее часто используются в настоящее время, она имеет ряд недостатков, ограничивающих ее использование. В частности, это наличие побочных эффектов, которые, в случае разных вирусов, выражаются или в токсичности, или повышенной иммуногенно-сти, или способности активировать протоонкогены и индуцировать образование патогенных вариантов вирусов за счет рекомбинации с эндогенными вирусами [2, 3]. Кроме того, как предполагается, клетка в ответ на функционирование вирусоспецифических участков регуляции генной активности способна вырабатывать механизмы их инактивации, что ограничивает время работы и уровень активности вирусоспецифичных векторов экспрессии [4].
В связи со сказанным, продолжается разработка невирусных способов доставки, основанных на использовании катионных носителей ДНК. Такие методы имеют меньшую эффективность, по сравнению с вирусными векторами, но обладают рядом достоинств. Главное их преимущество заключается в возможности неоднократного применения, что важно для лечения методами генотерапии таких хронических заболеваний как атеросклероз, диабет, ревматоидный артрит и т.д.
Недавно предложен метод гидродинамических внутривенных инъекций "голой" плазмидной ДНК лабораторным животным (мышам), который позволяет обходиться без каких-либо носителей. Более того, показано, что этот метод способен обеспечить весьма эффективную и продолжительную экспрессию генов "интереса" в организме-реципиенте [5-8]. Суть данного подхода заключается в том, что в кровоток мышей при гидродинамическом усилии вводится раствор ДНК (за несколько
секунд объемом 1-3 мл). При инъекции в хвостовую вену мыши почти две трети всей ДНК попадает в клетки печени, главным образом, в гепато-циты [5]. Попавшая в клетки ДНК сохраняется в клеточных ядрах в виде эписом. Несмотря на малую изученность процесса доставки "голой" ДНК гидродинамическим методом, этот метод уже использован на приматах [9], и в скором времени, по-видимому, он может быть адаптирован для лечения человека. Кроме того, данный метод переноса генов, по-видимому, является идеальным для оптимизации регуляторных районов генетической конструкции, поскольку дополнительные агенты (катионные носители, вирусные векторы), влияющие на уровень экспрессии перенесенного гена, отсутствуют.
В наших предыдущих работах основное внимание уделяли доставке гена аполипопротеина A-I (apoA-I) человека, проявляющего антиатероген-ные свойства, в печень крыс и мышей в комплексе с лизин-богатыми или аргинин-богатыми кати-онными носителями [10, 11].
Эндогенный аполипопротеин A-I (ApoA-I) синтезируется, главным образом, в печени и тонком кишечнике взрослого человека и секретируется в кровь, где существует в комплексе с липидами в виде липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и хиломикронов. Структура гена apoA-I, входящего в состав кластера на хромосоме 11 совместно с генами apoc-III и apo-IV, у человека и мыши высоко гомологична [12]. Регуляторные участки, включающие специфичный печеночный энхан-сер (-220...-77 п. н. относительно точки инициации транскрипции) apoA-I, как было установлено ранее, достаточны для его высокоэффективной экспрессии в клетках печени [13].
Целью настоящей работы явилось изучение условий эффективной и длительной экспрессии apoA-I человека в печени лабораторных мышей в зависимости от природы сцепленных с геном регуляторных участков транскрипции и от наличия интронов в кодирующей части apoA-I. В качестве средства доставки использовали метод гидродинамических внутривенных инъекций.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали линию клеток гепато-целлюлярной карциномы (гепатомы) человека -HepG2, получ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.