ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 3, с. 183-189
КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ^^^^^^^^^^ И ПРОЛИФЕРАЦИЯ
УДК 57.536:571.27
ПЕРИФЕРИЧЕСКИЙ ПУЛ Т-КЛЕТОК СБ8+ СОДЕРЖИТ ЛИМФОЦИТЫ С АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИМИ РЕЦЕПТОРАМИ, РАСПОЗНАЮЩИМИ СИНГЕННЫЕ МОЛЕКУЛЫ МНС КЛАССА II1
© 2004 г. Л. А. Побезинский, Е. Л. Побезинская, Т. С. Гриненко, А. В. Червонский*, Д. Б. Казанский
НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н И. Блохина РАМН 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24 *Джексоновская лаборатория, Бар Харбор, 04609 США Поступила в редакцию 02.12.02 г. Окончательный вариант получен 08.10.03 г.
Способность Т-лимфоцитов к распознаванию "чужого" и толерантность к "своему" формируются в результате процессов негативной и позитивной селекции в тимусе. Используя метод получения и тестирования специфичности Т-клеточных гибридом, мы показали, что значительная часть периферического пула Т-лимфоцитов CD8+ несет рецепторы, специфичные к "своим" молекулам MHC класса II. Такая неожиданная специфичность рецепторов обнаруживается у ряда Т-клеточных гибридом, полученных путем слияния активированных периферических Т-лимфоцитов CD8+ с опухолевым партнером, трансфецированным геном корецептора CD4. Реактивность гибридом к "своему" не является экспериментальным артефактом, связанным с увеличением авидности взаимодействия гибридомных клеток с антигенпрезентирующими клетками. Она также не является проявлением реактивности Т-клеток на суперантигены - продукты эндогенных вирусов рака молочных желез мышей. Показано, что в формировании пула таких Т-клеток принимают участие как клетки с двойной специфичностью рецептора, так и клетки, коэкспрессирующие две а-цепи ^клеточного рецептора. Появление их на периферии может быть следствием способности тимоцитов, дифференцирующихся в направлении клеток CD4+, избегать негативной селекции путем смены экспрессии корецептора CD4 на CD8.
Ключевые слова: T-клетка, тимус, негативная селекция, аутоиммунитет.
Одной из наиболее загадочных особенностей иммунной системы является способность к распознаванию "чужого" при отсутствии реактивности к "своему". Способность иммунной системы четко отличать "свое" от "чужого" представляется вполне естественной ввиду того, что иммунная система постоянно "видит" собственные антигены организма, реакция на которые могла бы его разрушить. Вместе с тем при попадании в организм чужеродных антигенов иммунная система должна иметь возможность устранить их и их носителей - бактериальные токсины и микроорганизмы, патогенные вирусы и клетки, инфицированные ими. Согласно современным представлениям, клетки, ответственные за функции адаптивного иммунитета, проходят в своем развитии стадию, на которой они чувствительны к
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 02-04-48686 и 02-04-49042), а также Межведомственной научно-технической программой "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего" (< 01.04/1).
слишком сильному сигналу, поступающему от сформированных ими клональных антигенспеци-фических рецепторов. Таким образом, клоны клеток с аутореактивными рецепторами подвергаются негативной селекции и элиминируются. С другой стороны, Т-клетки не могут созреть, если сигнал слишком слаб или отсутствует, что наблюдается у животных, дефицитных по экспрессии молекул главного комплекса гистосовмести-мости (MHC) - естественных лигандов антигенспецифических рецепторов Т-клеток. В процессе внутритимусной селекции эти рамки создают способность Т-лимфоцитов к распознаванию чужеродных антигенов и толерантность к собственным (Sebzda et al., 1999; Golgrath et al., 1999; Germaine 2002). Таким образом, периферические Т-лимфоциты несут отпечаток пройденной ими селекции в тимусе: негативной, ведущей к делеции высокоаффинных клонов, и позитивной, ведущей к созреванию и выходу на периферию клеток с рецепторами, обладающими промежуточной аффинностью к "своим" молекулам
CD4+CD8low CD4
DN
CD8
Рис. 1. Схема внутритимусного развития Т-клеток CD8+. Пути дифференцировки: ( ) - через стадию клеток DP и затем CD4+, ( ) - через стадию DP. DP -двойные позитивные Т-клетки, DN - двойные негативные Т-клетки.
MHC. Тимусная селекция является самой важной стадией жизненного цикла лимфоцитов, формирующей будущее разнообразие зрелых Т-клеток. Параллельно с вышеописанными процессами происходит детерминация путей развития тимо-цитов в клетки CD4+ и CD8+ (Ellmeier et al., 1999; Germaine, 2002). Механизмы, лежащие в основе дифференцировки клеток CD4+CD8+ в однопози-тивные зрелые клетки, до сих пор неизвестны и вызывают наибольший интерес у исследователей.
Несмотря на внутритимусную селекцию, часть аутоиммунных клеток способна избегать делеции и проникать на периферию. Это подтверждается тем, что аутоиммунными заболеваниями страдает более 5% человечества (Bouneaud et al., 2000; Feldmann, 2001; Lipsky, 2001; Steinman, 2001; Wandstrat, Wakeland, 2001; Weetman, 2001; Wucherpfenning, Eisenbarth, 2001). На сегодняшний день существует ряд гипотез, которые пытаются объяснить природу столь несовершенной негативной селекции и активацию аутоиммунитета (Benoist, Mathis, 2001; Ermann, Fathman, 2001; Anderson et al., 2002).
Недавно появился ряд публикаций (Uematsu et al., 1997; Brugnera et al., 2000; Correia-Neves et al., 2001; Bosselut et al., 2001), позволяющих предположить, что в пуле клеток CD8+ могут находиться аутоиммунные клетки с рецепторами, распознающими молекулы MHC классов I и II. Во-первых, установлено, что у мышей с трансгенным Т-кле-точным рецептором HY на генетической основе линии C57BL/6 (гаплотипа H-2b) происходит созревание только Т-клеток Т-клеточного рецептора (TCR) TCR-HY+CD8+, в то время как у мышей TCR-HY гаплотипа H-2d успешно образуются клетки TCR-HY+CD4+ и TCR-HY+CD8+ (Arsov,
Vucmanovic, 1999). Показано, что причина отсутствия трансгенных клеток CD4+ у мышей H-2b связана с их реактивностью на молекулу Ab (MHC класса II) и, следовательно, с негативной селекцией. Во-вторых, описано два пути дифференцировки T-клеток CD8+ из двойных позитивных тимо-цитов (DP) (рис. 1). Первый - традиционный, часть клеток DP сразу дифференцируется в клетки CD8+, в то время как второй включает в себя часть пути развития клеток CD4+ и образует промежуточную популяцию клеток CD4hlCD8low, и только затем происходит диффе-ренцировка в клетки CD8+ (Correia-Neves et al., 2001). Интересно отметить, что, несмотря на высокую экспрессию CD4, в этой промежуточной популяции Т-клеток активен сайленсер, выключающий его экспрессию (Uematsu et al., 1997).
Можно предположить, что часть Т-клеток CD8+ исходно пытается стать лимфоцитами CD4+, но, обладая рецепторами, взаимодействующими с высокой аффинностью со своими продуктами MHC класса II, не погибает, а меняет экспрессию корецептора с CD4 на CD8. Такой механизм позволил бы части Т-клеток с аутоиммунными рецепторами избежать гибели, вызванной негативной селекцией. Однако пройти позитивную селекцию на своих молекулах MHC класса I смогут только те клетки, которые обладают TCRs с двойной специфичностью. Если это так, то популяция клеток CD8 должна содержать лимфоциты с рецепторами, реактивными к своим молекулам MHC класса II, и одновременно распознавать "чужие" (аллогенные) молекулы MHC класса I. Задача данной работы - проверка вышеописанной гипотезы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Лабораторные животные. В работе использовали мышей следующих инбредных линий: C57BL/6J (H-2b), C57BL/6J-H2bm3/ER (bm3, H-2bm3), C57BL/6J-TCRatm1Mom (H-2b), BALB/cJ (H-2d), C3H/HeJ (H-2k), C57BL/10SnJ (H-2b), DBA/2J (H-2d), CBA/CaJ (H-2k), FVB/NJ (H-2q), B6.C-H2bm12/KhEg (bm12, H-2bm12), B10.D2 (H-2d). В скобках указан гаплотип комплекса H-2 линий мышей.
Смешанная культура лимфоцитов (MLR). Для получения Т-клеточных бластов CD8+ в качестве респондеров использовали клетки лимфатических узлов мышей линии C57BL/6J или мышей поколения FX(C57BL/6J (H-2b) х C57BL/6J-TCRatm1Mom - нокаутов по а-цепи TCR (TCR0/0, H-2b)). В качестве стимулятора использовали спленоци-ты мышей линии C57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3), предварительно обработанные митомицином C (25 мкг/мл/107 клеток, 30 мин, 37°C). Клетки респондеров и стимуляторов смешивали в соотношении 1 : 1. Смесь лимфоцитов в количестве 6 х 106
00 Q U
Сингенная MLR
2.1
73.9
1.4
22.6:;:
Аллогенная MLR
55.5 2.9
■8.1';-.'
CD4
Рис. 2. Специфическая пролиферация клеток CD8+ на 3-й сут в MLR (представлены результаты анализа бластных клеток с высоким показателем прямого рассеивания). Респондеры - клетки из лимфатических узлов мышей линии C57BL/6, стимуляторы - спленоциты мышей линии C57BL/6 (а) или C57BL/6J-H2bm3/ER (б), обработанные митоми-цином С.
на лунку раскапывали в 24-луночный планшет и инкубировали в полной среде (RPMI-1640), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 4 ммоль L-глутамина ("Flow", США), 20 ммоль HEPES ("Sigma", США) и 5 х 10-5 M 2-меркапто-этанола ("Merk", Германия) (37°С, 5%-ный С02). На 3-и сут культивирования собирали Т-клеточ-ные бласты.
Получение Т-клеточных гибридом. В качестве партнера для слияния использовали клетки ти-момы линии BW.CD4 ("Jackson Lab.", США). Клетки BW.CD4 и бласты CD8+ (3-х сут культивирования в MLR) смешивали в пропорции 1 : 1, центрифугировали 4 мин при 1500 g и инкубировали в среде без сыворотки в течение 20 мин (37°С, 5%-ный С02). После этого удаляли супернатант и добавляли полиэтил енгликоль 1500 ("Boehringer Mannheim", США) на 70 с. Затем отмывали два раза по 2 мин при 1000 g средой без сыворотки, добавляли 20 мл среды с сывороткой и инкубировали 45 мин (37°С, 5%-ный С02). Полученные клетки помещали в плоскодонный 96-луночный планшет в количестве 1 х 104 кл/лунку и инкубировали в полной среде. Через 2 сут добавляли селективную среду, содержащую гипоксантин, ами-ноптерин и тимидин ("Gibco BRL", США). Через 1-2 нед. тестировали выросшие гибридомы.
Тестирование гибридом. Гибридомы тестировали по продукции интерлейкина (IL-2) в ответ на специфические стимуляторы. Клетки гибридом активировали в течение 1 сут клетками стимулятора в 96-луночном планшете. Затем собранный супернатант добавляли к клеткам линии CTLL-2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.