научная статья по теме ПЕРИФЕРИЙНЫЙ СВЕТОСОБИРАЮЩИЙ КОМПЛЕКС LH2 МОЖЕТ СОБИРАТЬСЯ В КЛЕТКАХ ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ RHODOBLASTUS ACIDOPHILUS БЕЗ КАРОТИНОИДОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ПЕРИФЕРИЙНЫЙ СВЕТОСОБИРАЮЩИЙ КОМПЛЕКС LH2 МОЖЕТ СОБИРАТЬСЯ В КЛЕТКАХ ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ RHODOBLASTUS ACIDOPHILUS БЕЗ КАРОТИНОИДОВ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1420 - 1430

УДК 577.355.2

ПЕРИФЕРИЙНЫЙ СВЕТОСОБИРАЮЩИЙ КОМПЛЕКС LH2 МОЖЕТ СОБИРАТЬСЯ В КЛЕТКАХ ПУРПУРНОЙ НЕСЕРНОЙ БАКТЕРИИ Rhodoblastus acidophilus БЕЗ КАРОТИНОИДОВ

© 2015 М.А. Большаков, А.А. Ашихмин, З.К. Махнева, А.А. Москаленко*

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: +7(4967)330-532, электронная почта: andrey-moskalenko@rambler.ru

Поступила в редакцию 28.11.14 После доработки 01.04.15

Исследовано влияние каротиноидов на сборку комплекса LH2 в клетках пурпурной несерной бактерии Rhodoblastus acidophilus. Для этого культуру бактерий выращивали с ингибитором биосинтеза каротиноидов — дифениламином (ДФА) (в концентрации 71 ^M). Ингибитор снижал уровень биосинтеза окрашенных каротиноидов в мембранах на ~58%. Показано, что в них накапливалось большое количество фитоина. Установлено, что этот предшественник каротиноидов неспецифически связывается с комплексом LH2 и не стабилизирует его структуру. Тест на термостабильность выделенного комплекса LH2 в совокупности с анализом каротиноидного состава показал, что популяция этого комплекса является гетерогенной по составу каротиноидов. Часть комплексов LH2 с содержанием каротиноидов ~90% остается стабильной и не разрушается при нагревании в течение 15 мин при 50°. Другая часть комплексов LH2, содержащих, в среднем, менее одной молекулы каротиноидов на комплекс, разрушалась при нагревании, образуя зону свободных пигментов (и полипептидов). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что некоторая часть комплексов LH2 собирается без каротиноидов в клетках несерной бактерии Rhodoblastus acidophilus, выращенных с ДФА. Эти данные противоречат тому факту, что комплекс LH2 из несерных бактерий не может собираться без каротиноидов, но хорошо согласуются с результатами, полученными нами ранее для серных бактерий Allochromatium minutissimum и Ectothiorhodospira haloalkaliphila. Из клеток этих бактерий с использованием ДФА был получен бескаротиноидный комплекс LH2 (Москаленко и соавт., 2012; Ашихмин и соавт., 2014).

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фотосинтезирующие бактерии, фотосинтез, комплекс LH2, сборка, каротиноиды, ингибитор.

Комплекс ЬИ2 является основным комплексом в фотосинтетических мембранах пурпурных бактерий, в спектре поглощения которых в ближней ИК-области преобладают его полосы с максимумами при 800 и 855 нм. Функция этого комплекса заключается в поглощении энергии квантов света, преобразовании этой энергии в энергию электронного возбуждения и ее передаче через комплекс ЬИ1 к ЯС [1]. Эти процессы происходят в комплексе ЬИ2 с участием хромофоров БХл и каротиноидов, которые некова-

Принятые сокращения: БХл — бактериохлорофилл, ДМ — додецил ß-D-мальтопиранозид, ДФА — дифениламин, LH — светособирающий, RC — реакционный центр, ДФА-образец (мембрана, комплекс) — образец, полученный из клеток, выращенных с 71 ^M ДФА, Alc. — Allochromatium, Rb. — Rhodobacter, Rbl. — Rhodoblastus, Ect. — Ectothiorhodospira, Trs. — Thiorhodospira.

* Адресат для корреспонденции.

лентно связаны с полипептидами. Комплексы LH2 серных и несерных бактерий являются кольцевыми структурами, построенными из двух низкомолекулярных а- и р-полипептидов. Впервые это было показано в работах [2, 3]. Каждый комплекс LH2 состоит из 8—9 а/в-пар полипептидов (гетеродимеров) в зависимости от вида бактерий. Одним из наиболее изученных является комплекс LH2 из Rbl. acidophilus, для которого установлена структура с разрешением 2 А [4, 5]. Показано, что а/в-гетеродимер комплекса LH2 связывает три молекулы БХл. Две из них (БХл850, поглощение ~855 нм) расположены рядом с периплазматической поверхностью мембраны, а молекула БХл800 (поглощение ~800 нм) находится на цитоплазматической стороне [4—6]. Каждый а/в-гетеродимер некова-лентно связывает также одну молекулу кароти-ноида (родопин-глюкозид в Rbl. acidophilus). Его

глюкозидная группа располагается на цитоплаз-матической стороне комплекса. Полиеновая цепь каротиноида находится между а- и р-по-липептидами (гидрофобный «каротиноидный карман») и имеет изогнутую (twist) конформа-цию. Эта цепь каротиноида контактирует, как минимум, с 15 а.о. а/р-гетеродимера. Таким образом, каротиноид, который занимает центральную позицию в структуре комплекса LH2, в соответствии с общепринятой точкой зрения, играет важную роль, как в сборке, так и в стабилизации структуры этого комплекса из Rbl. acidophilus [4, 6, 7].

Бактериальные каротиноиды — это, как правило, С40 молекулы, которые состоят из восьми единиц изопрена. Их биосинтез в пурпурных бактериях, как было установлено, контролируется, по крайней мере, семью генами [8]. В настоящее время выделяют два основных пути биосинтеза каротиноидов у пурпурных бактерий: 1) спириллоксантиновый путь, который объединяет нормальный и необычный спирилло-ксантиновый пути, сфероиденовый и каротиналь-ный пути; 2) океноновый путь, который включает океноновый и Rg-кетокаротиноидный пути [9]. Большинство пурпурных бактерий принадлежат к спириллоксантиновой группе. Все пути каротиноидгенеза начинаются с синтеза фитои-на. Фитоиндесатураза катализирует процесс де-сатурации последнего, объединяя три стадии биосинтеза каротиноидов (фитоин^фитофлу-ин^^-каротин^нейроспорин), в результате чего происходит образование нейроспорина [10]. Затем следует ряд реакций десатурации, насыщения, циклизации и введения в молекулу ок-си/метокси- и глюкозидных групп.

Поскольку комплексы LH2 из серных и несерных бактерий построены по общему принципу (два низкомолекулярных а- и р-полипепти-да, три молекулы БХл и одна молекула кароти-ноида на один гетеродимер) и имеют похожие спектры поглощения в ближней ИК-области, то принципы их сборки в мембранах должны быть сходными. Тем не менее, существует некое противоречие при исследовании вопросов взаимодействия биосинтеза каротиноидов и сборки комплексов LH2 в клетках пурпурных бактерий. С одной стороны, установлено, что комплексы LH2 не собираются в клетках бескаротиноид-ных мутантов несерных бактерий [11—15]. В указанных мутантах выключены гены фитоин-синтетазы или фитоиндесатуразы. Во втором случае в клетках мутантов накапливается большое количество фитоина, что, тем не менее, не приводит к сборке комплекса LH2 [8, 14, 15]. Эти данные интерпретированы таким образом, что комплексы LH2 требуют для сборки и под-

держания стабильности их структуры присутствия молекул окрашенных каротиноидов [16]. С другой стороны, показано, что биосинтез ка-ротиноидов можно практически полностью (>99%) подавить в клетках серных бактерий, однако, комплекс LH2 собирается в их отсутствие [17—25]. Наиболее часто для подавления биосинтеза каротиноидов в клетках фотосинтезиру-ющих бактерий применялся ДФА [17, 23—25]. Он является ингибитором широкого спектра действия, который токсичен при высоких концентрациях. Поэтому иногда ДФА останавливает рост клеток на этапе, когда биосинтез каротиноидов подавлен только на 40—60%.

Представляло интерес исследовать, как ограниченный пул окрашенных каротиноидов может распределяться между комплексами LH2. В настоящей работе изучено влияние ДФА на сборку комплекса LH2 в клетках пурпурной несерной фотосинтезирующей бактерии Rbl. aci-dophilus. Проведена оценка реального распределения каротиноидов между ДФА-комплексами LH2 в одном пуле и сделан вывод, что этот комплекс может собираться in vivo без кароти-ноидов, подобно тому, как это происходит у пурпурных серных бактерий.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки Rbl. acidophilus 10050 выращивали при 28 ± 2° в стеклянных бутылках и средней интенсивности освещения около 10 Вт м-2. Питательная среда [26] содержала 71 ^M ДФА. Это стандартная концентрация ингибитора, соответствующая 12 мг/л, которая, как правило, используется для ингибирования биосинтеза каротиноидов [17, 20, 21, 23-25]. Более высокие концентрации ДФА (75 и 100 ^M) были использованы только в работе [7]. При выращивании культуру Rbl. acidophilus не защищали красным светофильтром для предотвращения разрушения ДФА (как в работах [17-19, 23-25]), так как ранее мы не наблюдали значительной фотодеструкции ДФА при выращивании бактерий на белом свету [20, 21].

Хроматофоры получали из клеток Rbl. aci-dophilus как описано ранее [20, 21]. Комплексы LH2 и LH1-RC выделяли с помощью электрофореза [27] из ДФА-мембран, обработанных ДМ. Для изучения гетерогенности ДФА-комплексов LH2 их нагревали при 50° в течение 15 мин в присутствии 2%-ного Triton X-100. Детергент использовали для предотвращения возможной необратимой агрегации части образца при нагревании. Фракции термостабильных и разрушенных (зона свободных пигментов) комплек-

сов LH2 разделяли на колонке с DEAE-Toyo-pearl 650S (1,0 х 3,5 см), уравновешенной 0,05 М Tris-HCl-буфером, рН 8,0, с 0,1%-ным Triton Х-100. Фракцию термостабильных комплексов LH2 элюировали 0,05 М Tris-HCl-буфером с 0,04 М NaCl, а фракцию свободных пигментов — с 0,14 М NaCl.

Количественное определение содержания каротиноидов проводили как описано ранее [20, 21, 28]. Пигменты экстрагировали с использованием смеси ацетон/метанол (7 : 2, V/V) с последующим их переводом в петролейный эфир. Смесь пигментов сушили выпариванием на роторном испарителе или под током аргона. Пигментные экстракты анализировали с помощью ВЭЖХ, используя колонку Spherisorb ODS2 C18 (4 х 250 мм, «Waters», США). ВЭЖХ система состояла из насоса LC 10ADvp с клапаном FCV 10Alvp и детектором SPD-M20A («Shimadzu», Япония), работающих под программным обеспечением LC-solution. После инъекции образца в течение первых 3 мин через колонку прокачивали раствор «А»(73%-ный ацетонитрил/вода (9 : 1) и 27%-ный этилацетат), который сменяли линейным градиентом 0—100% раствора «В» (этилацетат) в течение 35 мин при скорости потока 1,0 мл/мин. В конце эксперимента через колонку пропускали раствор «В» в течение 5 мин. Каротиноиды идентифицировали сравнением с известными образцами из различных штаммов бактерий в соответствии с их спектрами поглощения и временем выхода с колонки. Молярный коэффициент экстинкции для каждого ка-ротиноида, в соответствии с данными работы [7], составлял 1

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком