ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 2, с. 86-93
РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ^^^^^^ И УСТАНОВЛЕНИЯ СВЯЗЕЙ
УДК 591.3-148.11
ПЕРИНАТАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ МАММИЛЛО-ТЕГМЕНТАЛЬНЫХ
СВЯЗЕЙ У КРЫС1
© 2007 г. Е. В. Алпеева, И. Г. Макаренко
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: imakarenk@mail.ru Поступила в редакцию 17.07.06 г.
Исследование развития прямых аксональных связей маммиллярных тел гипоталамуса с вентральным и дорсальным тегментальными ядрами Гуддена (ядрами покрышки среднего мозга) проводили на фиксированном мозгу крыс с 14-го дня эмбрионального по 10-е сут постнатального развития с помощью метода диффузии липофильного флуоресцентного карбоцианинового красителя 1,1'-ди-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората по мембранам нейронов. Маркер наносили на область маммиллярных тел или в область покрышки среднего мозга и после инкубации в фиксаторе выявляли флуоресцирующие тела нервных клеток и нервные волокна в ткани мозга. Было обнаружено, что маммилло-тегментальный тракт начинает развиваться раньше других проводящих систем маммиллярных тел. На 14-15-е дни эмбрионального развития он выявляется в виде пучка аксонов, идущего от маммиллярных тел каудально в средний мозг. Группа нейронов в покрышке среднего мозга и их аксоны, следующие в составе маммиллярной ножки к маммиллярным телам, впервые были обнаружены на 19-й день эмбрионального развития. С момента рождения идет прогрессивное развитие маммилло-тегментального тракта и маммиллярной ножки. К 10-м постнатальным сут в среднем мозгу обособляются вентральное и дорсальное тегментальные ядра. Таким образом, впервые было описано формирование реципрокных связей маммиллярных тел с тегментальными ядрами среднего мозга в процессе перинатального онтогенеза у крыс.
Ключевые слова: гипоталамус, маммиллярные тела, вентральное и дорсальное тегментальные ядра среднего мозга, аксональные связи, карбоцианиновый краситель Ди-Ай, онтогенез, крысы.
Маммиллярные тела (МТ) являются специфическим парным образованием промежуточного мозга, локализованным в вентральной части заднего гипоталамуса.
Они считаются одним из основных элементов лимбической системы мозга и наряду с другими структурами относятся к кругу Пэйпеца ('Papez circuit', Papez, 1937). Эта система последовательно включает гиппокамп, МТ, ядра переднего та-ламуса и поясную извилину коры мозга (Mark et al., 1995; Morgane et al., 2005). Она обеспечивает эмоциональный настрой и побуждение к действию (мотивации и эмоции), а также процессы научения и запоминания (Шеперд, 1987).
Исследованиям морфологии МТ и их связей у взрослых крыс посвящено много работ. В соответствии с терминологией Гардиана (Gurdjian, 1927) и на основе сведений о цитоархитектонике и связях МТ (Allen, Hopkins, 1988) в их составе были выделены латеральное и медиальное маммиллярные ядра, которые, как показано в физиологических экспериментах, играют важную роль в
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 04-04-48073-a).
пространственной навигации (Llinas, Alonso, 1992; Blair et al., 1999; Sharp et al., 2001) и в образовании пространственной памяти (Kopelman, 1995; Sziklas, Pertides, 1998; Kocsis et al., 2001). При помощи метода импрегнации серебром и с использованием прижизненных трейсеров было установлено, что большинство нейронов обоих ядер посылают аксоны в передний таламус посредством маммилло-таламического тракта (Cruce, 1975; Watanabe, Kawana, 1980; Seki, Zyo, 1984; Guison et al., 1995) и в средний мозг посредством маммилло-тегментального тракта (Cajal, 1911; Petrovicky, 1973; Cruce, 1977; Allen, Hopkins, 1990; Hayakawa, Zyo, 1990b). Эти тракты являются компактными мие-линизированными волоконными системами. Афферентные проекции к МТ от вентрального и дорсального тегментальных ядер среднего мозга осуществляются не через маммилло-тегментальный тракт, а с помощью другой проводящей системы, именуемой маммиллярной ножкой (Petrovicky, 1973; Allen, Hopkins, 1989; Hayakawa, Zyo, 1991). Было показано существование определенной топографической организации тегменто-маммил-лярных проекций: более рострально расположенные нейроны в тегментальных ядрах проециру-
ются в медиальные области МТ, а более каудаль-но расположенные - в латеральные (Shibata, 1987).
Известно, что у крыс маммилло-тегменталь-ный тракт начинает развиваться намного раньше других проводящих систем МТ (Coggeshall, 1964). В работах, посвященных изучению образования и организации нейронов и трактов в мозгу у мышей, также было показано, что маммилло-тег-ментальный тракт формируется одним из первых (Easter, Ross, 1993; Mastick, Easter, 1996). Однако из всех имеющихся в нашем распоряжении данных не складывается ясной картины развития проводящих систем, связывающих МТ с ядрами среднего мозга, тогда как исследование ранних этапов развития внутримозговых связей, когда они еще не достигли сложности, характерной для взрослых животных, представляет большой интерес и может внести существенный вклад в представления о развитии нервной системы в целом.
Цель настоящей работы - подробное исследование формирования основных проводящих путей, связывающих МТ с областью покрышки среднего мозга, в процессе перинатального развития у крыс. Использован метод антероградного и ретроградного распространения липофильного карбоцианинового красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората по липидному слою мембран нейронов (Vercelli et al., 2000) - один из немногих, позволяющих изучать внутримозговые связи у плодов и неонаталь-ных животных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на крысах Вистар с датированной беременностью. День обнаружения спермы во влагалище самки считали нулевым днем беременности (Э0), а день рождения - нулевым днем постнатального развития (П0). Для исследования использовали плоды крыс и постнатальных животных на разных сроках развития/шт.: Э14/5, Э15/2, Э16/1, Э19/2, Э20/4, Э21/3, П1/3, П2/4 и П10/4. Для извлечения плодов из матки самок наркотизировали введением внутрибрюшинно раствора нембутала в физиологическом растворе (0.9%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде) из расчета 4 мг на 100 г веса животного. Постнатальным крысятам перед перфузией вводили наркоз аналогичным образом. Эмбрионы на Э14-Э16 перфузировали через левый желудочек сердца физиологическим раствором для удаления крови из кровеносных сосудов, де-капитировали и помещали целые головы, не извлекая мозга из черепа, для фиксации в 4%-ный раствор параформальдегида (ПФА) на 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.2-7.4 на 1 сут. Плоды на Э19-Э 21 и постнатальных животных перфузировали через левый желудочек сердца сначала фи-
зиологическим раствором, а затем ПФA. Moзг извлекали из черепа и помещали в ПФA комнатной температуры на 12-20 ч. Далее на фиксированный мозг наносили кристаллы липофильного карбоцианинового красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората №-Ah, "Molecular Probes", INC, OTA). Нанесение Ди^й осуществляли под бинокулярной лупой с помощью стеклянного капилляра как на целый мозг через прокол вентральной поверхности MT, так и на мозг, разделенный вдоль по средней линии на две половины. В первом случае с области MT удаляли мозговые оболочки, подсушивали мозг с помощью фильтровальной бумаги, делали прокол вентральной поверхности MT, куда и помещали кристаллы маркера. Во втором случае Ди-Añ наносили на срез на разные области мозга: MT, соседние участки ростральнее и каудальнее MT, область ядер покрышки среднего мозга. Moзг с маркером хранили в ПФA в темноте при комнатной температуре от 6 до 12 мес, в течение которых происходила диффузия молекул липофильного маркера по липидному слою мембран нейронов в ретроградном и антероградном направлениях. Дальнейшее исследование проводили на сериях вибратомных коронарных и сагиттальных срезов толщиной 100 мкм, заключенных в мовиол ("Calbiochem", Германия). Препараты анализировали в фотомикроскопе Leica DM RXA2 (Германия), оснащенном системой фильтров для выявления оранжево-красной родамино-вой флуоресценции, характерной для Ди-A^ После оценки распределения кристаллов маркера в месте введения с использованием ультрафиолетового фильтра серии срезов мозга последовательно просматривали, описывая локализацию окрашенных Ди^й нервных волокон и нейронов. Фотосъемку препаратов проводили с помощью цифровой фотокамеры Olympus DP70 (Япония) и специальной компьютерной программы для съемки, поставляемой вместе с ней (Dp controller и DP manager). Обработку и монтаж цифровых изображений для иллюстрации полученных результатов осуществляли при помощи компьютерной программы Photoshop 7.0 ("Adobe", CШA). Идентификацию отделов и ядер мозга проводили с использованием атласов развивающегося мозга (Altman, Bayer, 1986; Paxinos et al., 1991) и мозга взрослой крысы (Paxinos, Watson, 1997).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение Ди-Ай в месте его нанесения на задний гипоталамус. В каждом случае проводили анализ распространения маркера в области его нанесения. На ранних эмбриональных стадиях развития (Э14-Э16) у MT еще нет капсулы из нервных волокон, характерной для взрослых крыс. Нанесение Ди^й каудальнее воронки ги-
Рис. 1. Распределение меченых нейронов и волокон в мозгу крыс на 14-16-й дни эмбрионального развития (Э14-Э16) при нанесении кристаллов Ди-Ай на область маммиллярных тел (а-г) и на средний мозг (д): а - Э15, коронарный срез мозга на уровне закладки маммиллярных тел; б - Э15, коронарный срез среднего мозга; в-д - сагиттальные срезы мозга (Э15, Э16 и Э14 соответственно).
МТ - маммиллярное тело; МТе - маммилло-тегментальный тракт; ОМТ - основной маммиллярный тракт; IV - четвертый желудочек мозга; (-—) - меченые нейроны в каудальной части среднего мозга. Масштаб: 200 мкм.
пофиза приводит к выявлению мощного пучка волокон, выходящего дорсально из зоны мечения (рис. 1, а). Он был идентифицирован нами как основной маммиллярный тракт, являющийся началом маммилло-тегментального тракта, и служил критерием точности нанесения Ди-Ай. Смещение прокола ростральнее в область
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.