БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 438-444
УДК 576.08,57.085.23
ПЕРОКСИД ВОДОРОДА МОДУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ПУПОЧНОЙ ВЕНЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ in vitro
© 2013 г. И. В. Кудрявцев1-3, В. В. Гарнюк4, А. Д. Надеев5, Н. В. Гончаров4, 6*
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12 2Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 3Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург 4Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России,
Санкт-Петербург
5Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, Институтская, 3 6Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223, Санкт-Петербург, просп. Тореза, 44; *электронная почта: ngoncharov@gmail.com Поступила в редакцию 29.04.2013
Цель работы состояла в определении иммунологического фенотипа эндотелиальных клеток пупочной вены человека в культуре и динамики экспрессии индуцибельных поверхностных CD-молекул этих клеток при воздействии экзогенного пероксида водорода (H2O2, 100—300 мкМ) in vitro. В качестве положительного контроля использован форболовый эфир. Через 3 ч после воздействия наблюдалось незначительное (9—21%) повышение плотности экспрессии CD31 при всех концентрациях добавленного H2O2, статистически значимое снижение экспрессии CD309 (15—20%) отмечено при воздействии 200 и 300 мкМ Н2О2. Через 1 сут уровень CD54 повышался существенно и дозозависи-мо, а экспрессия всех исследованных CD-молекул умеренно усиливалась.
Ключевые слова: пероксид водорода, эндотелиальные клетки, CD-антиген, экспрессия.
Б01: 10.7868/80233475513050101
В начале 1930-х годов был описан феномен окислительного (дыхательного) взрыва при фагоцитозе [1]. Эта работа положила начало многочисленным исследованиям роли активных форм кислорода (АФК) в биологических процессах и системах. Высокие концентрации АФК в норме являются характерной функцией так называемых профессиональных фагоцитов — клеток врожденного иммунитета; в других клетках высокие концентрации АФК считаются признаком окислительного стресса. В низких концентрациях АФК постоянно образуются практически во всех клетках организма и выполняют сигнальные функции в качестве вторичных посредников в редокс-чув-ствительных сигнальных путях [2]. Известно, что действие окислительного стресса не сводится к перекисному окислению липидов (ПОЛ). Так, в кардиомиоцитах пероксид водорода (Н2О2) инги-
Сокращения: АФК — активные формы кислорода, ПОЛ — перекисное окисление липидов, PMA — форболовый эфир, VWF — фактор фон Виллебранда, ТВП — тельца Вейбеля— Палада, АПФ — ангиотензин-превращающий фермент.
бирует, в первую очередь, аконитазу и, как следствие, цикл Кребса, даже если концентрация Н2О2 недостаточна для запуска ПОЛ [3]. Эндотелий сосудов играет важнейшую роль в поддержании гомеостаза, он же, как правило, служит и мишенью, и одним из источников АФК. По некоторым данным концентрация как эндогенных, так и экзогенных АФК может достигать 500 мкМ [4, 5]. В число экзогенных источников АФК входят гемоглобин эритроцитов, миелопероксидаза нейтрофи-лов, МАЭРН-оксидаза нейтрофилов, макрофагов и тромбоцитов [6]. Окислительный стресс повышает проницаемость гематотканевых барьеров. АФК вносят решающий вклад в развитие патологии легких и головного мозга при гипероксии и гипоксии [7, 8]. Нарушение проницаемости клеток эндотелия может быть связано с воздействием АФК или активных форм азота на ключевые ферменты метаболизма [7, 9], а также на различные звенья сигнальных и эффекторных путей — рецепторы плазматической мембраны, киназы и фосфатазы, транскрипционные факторы и процесс их взаимо-
действия с ДНК, трансляция, процессинг и секреция интегринов и белков адгезии, цитоскелет и его взаимодействие с плазматической мембраной [5]. Механизмы нарушения барьерной функции эндотелия могут отличаться в зависимости от активирующего агента, преобладающего или первичного вида АФК. Например, действие фактора некроза опухолей а (TNF-а) на эндотелиальные клетки опосредуется пероксинитритом, который вызывает нарушение целостности эндотелия в результате нитрирования белков цитоскелета — актина или р-катенина [10]. В то же время, действие TNF-а на эндотелиальные клетки связано с активацией протеинкиназ, фосфорилированием и повышением экспрессии молекул адгезии [11].
Несмотря на экспериментальные данные, свидетельствующие о важной роли АФК в сигнальных и метаболических путях эндотелиальных клеток, очень мало известно о дозовой зависимости, динамике процессов и взаимодействии сигнальных систем, обусловливающих изменение проницаемости эндотелия в условиях окислительного стресса. В настоящей работе представлены новые данные о наличии некоторых инду-цибельных поверхностных CD-молекул на эндо-телиальных клетках в культуре и о динамике изменения их экспрессии при воздействии экзогенного H2O2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пуповина новорожденных была получена при нормальных родах в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. Эндотелиальные клетки выделяли из пупочной вены человека по методике [12] с модификациями [13, 14]. В работе использовали растущие в 24-луночных планшетах клетки второго—третьего пассажа, достигшие плотного монослоя (около 100000 клеток/см2). Для снятия клеток применяли раствор аккутазы (Sigma). Уровень экспрессии поверхностных антигенов оценивали с использованием клеток, собранных из четырех соответствующих лунок (площадь лунки 2 см2), для определения показателей в контроле и при каждой концентрации исследуемого вещества. На каждую временную/концентрационную точку использовали не менее 8000 живых эндотелиальных клеток. Анализ проводили на проточном цитометре Navios™ (Beckman Coulter, США). Антитела к CD-молекулам были получены от следующих фирм-производителей: CD143-PE — производства Biolegend, VWF-АРС — R&D Systems Inc., CD29-FITC, CD31-FITC, CD106-PE, CD54-PE, CD309-PC7 - Beckman Coulter. Окрашивание антителами производили в соответствии с рекомендациями производителей, отрицательным контролем служили соответствующие изотипические антитела. Использовали H2O2 фирмы ПроХим в концентрации 100, 200 и 300 мкМ, в качестве положительного контроля
использовали форболовый эфир (PMA, Sigma, 25 нг/мл), а также — на первом этапе работы — карбахол (Sigma, 5 мкг/мл).
Результаты обрабатывали с использованием пакета прикладных статистических программ GraphPad Prism v.5.04. Экспрессию CD-молекул под действием различных концентраций H2O2 и зависимости от времени инкубации по каждому из действующих факторов оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа. Учитывая малое число измерений (n = 3), использовали непараметрические критерии Крускала-Уоллиса и Данна. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе необходимо было определить, какие антигены представлены на клетках исследуемой культуры эндотелиальных клеток и какие из них индуцируются при воздействии активаторов. Экспрессию CD-молекул определяли через 5 и 24 ч после добавления активаторов к клеткам. Результаты представлены в таблице. К CD-молекулам, экспрессируемым на поверхности практически всех клеток (90—100%), относятся CD29, CD31, CD61 и CD143. Некоторые CD-молекулы представлены на поверхности 3— 65% клеток: это CD106, CD309, CD34 и CD54. Антигены, экспрессия которых изменялась под действием РМА, в той или иной степени реагировали на H2O2. В то же время, карбахол не действовал на экспрессию CD54 и CD106, поэтому в дальнейшем мы не использовали его в качестве второго или альтернативного позитивного контроля.
CD61 (или р3-интегрин) — белок, участвующий в адгезии тромбоцитов, долгое время считавшийся маркером исключительно этих клеток, был обнаружен на поверхности эндотелиальных клеток, где он связывается с некоторыми белками, в частности, с дисульфидизомеразой [15]. Данный антиген экспрессируется на поверхности 100% клеток в культуре, однако его уровень не изменялся под действием ни одного из апробированных агентов, поэтому мы не определяли его в дальнейшем. По этой же причине мы не определяли экспрессию CD34 — гликопротеина, обеспечивающего межклеточную адгезию стволовых клеток и эндотелиальных клеток-предшественников; количество клеток с этим маркером (15%) позволяет более определенно (в отличие от CD61) говорить о его конститутивности (или неиндуци-бельности) при воздействии используемых агентов в указанных временных рамках. Фактор Вилле-бранда (VWF), наряду с тельцами Вейбеля—Палада (ТВП), ангиотензин-превращающим ферментом (АПФ, CD143) и характерной для монослоя морфологией "булыжной мостовой", ранее относили к числу немногих обязательных критериев, подтверждающих аутентичность и чистоту эндотели-
440 КУДРЯВЦЕВ и др.
Экспрессия СБ-молекул клетками эндотелия пупочной вены человека в культуре и наличие реакции на стимуляцию
CD-антиген Контроль, % PMA, 25 нг/мл H2O2, 300 мкМ Карбахол, 5 мкг/мл
5 ч 24 ч 5 ч 24 ч 5 ч 24 ч
CD29 100 — т — т — т
CD31 100 т т т т т —
CD64 0 — — — — — —
CD38 0 — — — — — —
CD18 0 — — — — — —
CD50 0 — — — — — —
CD 106 3 тт т т т — —
CD11b 0 — — — — — —
CD54 65 ттт ттт т ттт — —
CD32 0 — — — — — —
HLA-DR 0 — — — — — —
CD61 100 — — — — — —
CD16 0 — — — — — —
CD69 0 — — — — — —
CD34 15 — — — — — —
CD309 8 — т — тт т т
CD143 90 т тт т т т —
PTEN 30 — — — —
VWF 80 1 т 1 Нет данных 1 Нет данных
Примечание. Контроль — % клеток, экспрессирующих антиген. "Т" или — слабое повышение или уменьшение уровня экспрессии (до 20%); "ТТ"- повышение уровня экспрессии средней степени (20—50%); "ТТТ" — значительное повышение уровня экспрессии (более 50%); "—" — отсутствие реакции на стимуляцию.
альных клеток в культуре [12, 16]. В нашем эксперименте VWF определен в 80% клеток. Через 5 ч после добавления любого из трех используемых соединений уровень VWF снижался, что связано, очевидно, с экзоцитозом содержимого ТВП. Однако в дальнейшем мы не измеряли уровень VWF, поскольку для определе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.