научная статья по теме ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛОВ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 625-629

УДК 665.58.002.33(088.8)

ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛОВ

© 2004 г. Т. И. Давиденко

Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 65080, Украина;

e-mail: physchem@paco.net Поступила в редакцию 28.10.2003 г.

Частично очищенная пероксидаза хрена эффективно трансформировала фенольные соединения (фенол, о-хлорфенол, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол с образованием нерастворимых в воде полимерных продуктов, резорцин и тимол с образованием низкомолекулярных соединений). Определены оптимальные условия пероксидазного окисления, приводящие к максимальной степени удаления фе-нольных соединений: температура 15-25°С для фенола, 25-30°С для хлорфенольных соединений, мольное соотношение Н2О2-фенол 1 : 1, время трансформации 1-3 ч, наибольшая степень трансформации наблюдалась в широком интервале рН, несколько увеличиваясь при рН 6.0-7.5. Предложено многократно проводить пероксидазное окисление фенолов, используя частично очищенную перок-сидазу, содержащуюся в диализной мембране, которая помещается в раствор фенольного соединения с добавлением пероксида водорода.

Фенолы - высокотоксичные соединения, оказывающие крайне неблагоприятное действие на живой организм. Они блокируют сульфгидриль-ные группы жизненно важных ферментов, нарушая окислительно-восстановительные реакции в клетках организма и интенсивно поглощают при своем окислении растворенный в воде кислород [1]. Пары фенола опасны при концентрации выше 0.001 мг/дм3. Почти 90% фенолов задерживаются в легких. ПДК фенолов варьируют от 0.1 до 0.001 мг/дм3. Фенолы, сбрасываемые со сточными водами в водоемы, интенсивно поглощают при своем окислении растворенный в воде кислород, что отрицательно сказывается на жизнедеятельности живых организмов и растений. К этому следует добавить, что фенол образуется и в результате жизнедеятельности человека при обмене белков и аминокислот (тирозин, фенилаланин). При нарушении нормального функционирования печени главный естественный путь его детокси-кации перестает действовать, что ведет к накоплению фенола в организме человека, повышает его концентрацию в крови на порядок, в результате наблюдаются такие патологии, как перитонит, панкреатит, печеночная недостаточность, экзогенные отравления [2]. Деструкция микроорганизмами пестицидов (особенно хлорорганичес-ких) проходит через их дехлорирование, дегид-рохлорирование с последующим окислением до фенолов [3].

Фенольные сточные воды образуются во многих производствах и в зависимости от условий содержат различные количества фенолов. Однако несмотря на большое число существующих методов деструкции фенолов, практически все они имеют ряд ограничений в своем применении. Для

них характерны такие недостатки, как высокая стоимость, неполнота очистки, образование вредных побочных продуктов и низкая эффективность. Кроме того, для некоторых фенольных соединений и при их низких концентрациях нет удовлетворительных методов удаления фенолов.

Цель работы - изучение возможности использования препарата частично очищенной перокси-дазы хрена (ПХ) для трансформации фенола и его хлорзамещенных производных в модельных экспериментах.

МЕТОДИКА

Выделение ПХ (КФ 1.11.1.7). Препарат частично очищенной ПХ выделяли следующим образом: очищенные корни хрена измельчали; полученный сок пропускали через несколько слоев марли, добавляя 0.1 объема 0.1 моль/дм3 раствора К2НРО4, после чего центрифугировали при 6000 § 15 мин. К полученному супернатанту при 4°С прибавляли насыщенный водный раствор сульфата аммония до степени насыщения 35%. Выдерживали раствор 60 мин, затем добавляли к супернатанту указанный раствор до степени насыщения 90% и оставляли для осаждения на 1 сут при 4°С. Выпавший осадок отделяли центрифугированием (15 мин при 8000 §), суспендировали в минимальном объеме 0.05 моль/дм3 трис-НС1 буфера, рН 7.0, проводили диализ против этого же буферного раствора 12 ч. Содержание ПХ в препарате (%) определяли с учетом коэффициента поглощения ПХ при 403 нм и концентрации общего белка, определенного по методу Лоури в модификации Хартри [4].

Таблица 1. Характеристика препаратов ПХ

Препарат ПХ RZ Содержание белка, мг/г препарата

"Reanal" (Венгрия) 0.6 715.1

"Serva" (Германия) 0.5 578.5

Из корней хрена* 0.3 4425*

Из Coprinus miacens* 0.3 1420*

Из сока хрена** 0.6 15000-20000 (**)

Из сока редьки** 0.6 17000 (**)

* Препарат выделен нами, содержание белка, мг/дм3 сока. ** Препарат выделен согласно [7], содержание белка, мг/дм3 сока.

Определение активности ПХ. Для определения активности ПХ 1 см3 раствора, содержащего 1 ммоль фенола в качестве субстрата, 1 ммоль пе-роксида водорода как окислителя и 40-80 мкг препарата ПХ инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливали, вводя равный объем 0.2 моль/дм3 раствора NH4OH, после чего определяли остаток непрореагировавшего фенола 4-аминоантипириновым методом [5].

Количественно величину степени трансформации оценивали, определяя процент удаленных фенолов из раствора.

Используемые субстраты. Рассмотрели трансформацию фенола, о-хлорфенола, пентахлорфе-нола, резорцина и тимола производства "Janssen Chimica" (Бельгия), 2,4,6-трихлорфенол - Ангарского завода химреактивов (Россия), определение которых проводили согласно [5]. Чистоту фенолов контролировали методом тонкослойной хроматографии ("Silufol UV-254", Чешская республика, система растворителей - хлороформ-гек-сан-ацетон 3 : 2 : 2).

Определение рН-оптимумов трансформации фенолов. Проверили трансформацию фенолов ПХ в области значений рН 3.5-7.5, используя следующие буферные растворы: глициновый, глицин-HCl-NaCl (рН 2.5-4.5), ацетатный, АсОН-№ОН (рН 4.0-5.5), фосфатный, КНРО4-№ОН (рН 5.57.5), трис-На (рН 7.5-8.5).

Влияние температуры. Трансформацию фенола ПХ рассмотрели в интервале 20-45°С при рН 7.0. Концентрации фенола и пероксида водорода составляли по 1 мМ.

Многократное использование ПХ. При изучении многократного использования ПХ при окислении фенолов раствор ферментного препарата в диализной мембране помещали в пробирку, содержащую 10 см3 буферного раствора с 1 мМ фенола и 1 мМ пероксида водорода. Через 30 мин мембрану с препаратом ПХ переносили в пробирку с аналогичными растворами. Степень трансформации фенольных соединений оценивали по

убыли субстрата, отнесенной к его исходному количеству и выражали в процентах.

Влияние добавок на активность ПХ и ее стабилизацию при многократном использовании рассматривали, добавляя в диализную мембрану Са2+ - 1 мМ, Мп2+ - 1.5 мМ, полиэтиленгликоль 6000 - 1%-ный раствор, поливинилпирролидон 12000 - 1%-ный раствор, приготовленные на 0.0167 моль/дм3 К-фосфат-ном буфере.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Пероксидаза хрена катализирует окисление пе-роксидом водорода субстратов различной функциональности, в том числе и фенолов [6]. Довольно высокая стоимость чистого препарата ПХ и данные о зависимости ПХ-активности от условий произрастания растения [7] послужили стимулом использовать для окисления фенолов частично очищенную ПХ.

Как следует из данных табл. 1, коммерческих препаратов и экстрактов сока редьки и хрена, выделенных в работе [7], в 2 раза превышали величину выделенных нами препаратов ПХ. Однако эффективность трансформации фенольных соединений, определенная по окислению о-хлор-фенола рассмотренными препаратами, была сравнимой. В связи с этим. мы предложили использовать для удаления фенолов частично очищенную ПХ.

Сущность данного метода состоит в следующем: ПХ катализирует окисление фенолов в присутствии пероксида водорода. В ходе окисления образуются соответствующие свободные радикалы фенолов, которые диффундируют из активного центра фермента в раствор, а затем полимери-зуются с образованием полиароматических продуктов.

Механизм катализа окисления фенолов ПХ, хорошо известен [8, 9]:

Е + Н2О2 —► Ех + Н2О Ех + РЮН —► Е2 + РЮ^ Е2 + РЮН —► Е + РЮ^ п(РЮ^ + РЮ^) —► полимерный продукт,

где Е - ПХ, а Ех и Е2 - ее активные формы, РЮН - фенол.

Продукты трансформации фенолов ПХ. Для

всех рассмотренных фенолов (кроме резорцина и тимола) в большей или меньшей степени наблюдали образование нерастворимых в воде полимеров красно-коричневого цвета, выход и состав которых зависел от условий трансформации. Они не растворялись также в диэтиловом эфире, спирте, ацетоне, хлороформе, бензоле, слабо растворялись при нагревании в диметилформамиде и диме-тилсульфоксиде, при 240-260°С обугливались.

Данные ИК-спектров показали наличие полосы поглощения гидроксильных групп в области 34003200, 1335 и 1180 см-1, эфирной связи -С-О-С-, относящейся к ароматическому эфиру, при 1200 см-1 для продукта окисления фенола; о-хлорфенола и 2,4,6-трихлорфенола - при 1093 и 1027 см-1; полосы поглощения ароматического кольца при 1485, 1590, 3060 см-1, что позволяет предположить образование полиоксифениленоксидов.

Наличие ОН-группы в образующихся полимерах было показано при получении ацетопроиз-водных в реакции с уксусным ангидридом в пиридине в присутствии серной кислоты как катализатора.

В масс-спектрах регистрировали образование осколочных ионов, масса которых соответствовала определенным фрагментам полиоксифениленоксидов: диоксидифениловому эфиру, в случае 2,4,6-трихлорфенола и пентахлорфенола присутствуют ионы с отщепленными атомами хлора.

Существенная особенность этих полимеров -практическая нерастворимость в воде. Это позволяет легко отделять их фильтрованием или центрифугированием.

Условия трансформации фенолов ПХ. Учитывая, что эффективность удаления фенолов из растворов зависит от условий проведения трансформации, изучили влияние рН в интервале 3.5-7.5. Как следует из данных табл. 2, высокая степень трансформации наблюдалась в широком диапазоне рН, несколько увеличиваясь в интервале 6.07.5. Сравнение с известными данными литературы [8, 10], полученными с использованием препарата ПХ фирмы "Sigma" (США), показало, что для о- и м-хлорфенолов наибольшая степень трансформации отмечена при рН 7.0, тогда как для фенола при рН 3.5 и 7.5.

При трансформации фенола частично очищенной ПХ при 15-25°С окислялась е

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком