ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 447, № 2, с. 235-237
^ ОБЩАЯ
БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.193.042
ПЕРОКСИДАЗЫ ANTHOCEROS NATALENSIS, ЭВОЛЮЦИОННОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА СОСУДИСТЫХ РАСТЕНИЙ © 2012 г. А. В. Часов, Р. П. Бекетт, Ф. В. Минибаева
Представлено академиком И.А. Тарчевским 03.05.2012 г. Поступило 12.05.2012 г.
Антоцеротовидные (Ап&осегоШрИ^а) — одни из древнейших наземных растений, появившиеся около 450 млн лет назад и насчитывающие всего 200—250 видов [1]. Благодаря своему цитологическому и морфологическому сходству как с водорослями, так и с высшими растениями антоцеротовидные стали объектом пристального внимания молекулярных биологов и генетиков [2—4]. До недавнего времени антоцеротовидные рассматривались как один из классов моховидных, однако в настоящее время они выделены в самостоятельный отдел в систематике растений [4]. Филогенетический и структурный анализы позволяют предположить, что в эволюционном плане антоцеротовидные являются сестрой современных сосудистых растений и происходят от общего предка [3, 4]. Вероятно, древние антоцеротовид-ноподобные явились промежуточным звеном при переходе от организмов, где в жизненном цикле доминирует поколение с гаплоидным гаметофи-том, к организмам с диплоидным спорофитом [3]. Известно, что антоцеротовидные являются чрезвычайно засухоустойчивыми и обладают феноменальной особенностью сохранять жизнеспособность при потере 95% воды [5]. Несмотря на очевидную важность, биохимические механизмы устойчивости, в том числе кинетические характеристики окислительно-восстановительных реакций, в клетках антоцеротовидных практически не изучены. При стрессе в клетках бриофитов так же, как и у большинства растений, может происходить повышение уровня активных форм кислорода (АФК) [6], в образование и детоксикацию которых вовлечены многочисленные окислительно-восстановительные ферменты и низкомолекулярные антиоксиданты. В клетках сосудистых растений, например, в корнях пшеницы, одними из ключевых ферментов редокс-метаболизма при стрессе являются апопластные пероксидазы, об-
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук School of Life Sciences, University of Kwazulu Natal, South Africa
ладающие способностью как к образованию АФК, так и разложению Н202 [7, 8]. Несмотря на интенсивное изучение химизма реакций и эволюции структуры пероксидаз [9], возможные механизмы и факторы, способствующие стимулированию АФК-образующей активности пероксида-зы, остаются неразрешенными. Перспективным приемом решения этой проблемы может стать изучение неизвестных до настоящего времени особенностей функционирования пероксидаз ан-тоцеротовидных, стоящих на более низкой в сравнении с сосудистыми растениями эволюционной ступени. В связи с вышеизложенным задачей настоящего исследования было проведение анализа кинетических характеристик пероксидаз антоцеротовидных и выявление возможного участия этих ферментов в образовании АФК в стрессовых условиях.
Для изучения активности окислительно-восстановительных ферментов Ап&осею па1а1еп815 81ерИ., собранного в заповеднике РегпсИАе, ЮАР, было проведено фракционирование белков клеточной стенки [10]. Регидратацию (1 ч) после 50%-го обезвоживания проводили в дистиллированной воде [11]. Активность ферментов определяли спектрофотометрическим методом в гомоге-нате или фракциях клеточной стенки по образованию продукта или расходованию субстрата. В качестве субстратов использовали о-дианизидин (X = 460 нм; б = 30.0 мМ-1 • см-1), 3,4-дигидроксифе-нилаланин (ДОФА, X = 475 нм; б = 3.6 мМ-1 • см-1), аскорбиновую кислоту (X = 265 нм; б = 8.24 мМ-1 • см-1), Н20 (X = 240 нм; б = 40 мМ-1 • см-1).
Показано, что 50%-е обезвоживание таллома в течение суток приводило к увеличению активности внутриклеточной пероксидазы более чем в три раза (рис. 1). При последующей регидратации уровень активности пероксидазы не изменялся. Интересно, что активность пероксидазы обнаруживалась и в экстраклеточном растворе, в котором проводили регидратацию. Таким образом, пероксидаза антоцероса, как и пероксидаза пшеницы [7], высокомобильна и активируется при стрессовом воздействии. Ранее нами впервые бы-
235
8*
236
ЧАСОВ и др.
о-Дианизидин окисленный, нмоль/г сух. массы • с
f
1200 1000 800 600 400 200 0
Рис. 1. Активность пероксидазы в гомогенате А. па1а1-еш18: 1 — контроль, 2 — после обезвоживания в течение 24 ч, 3 — после обезвоживания в течение 24 ч и 1 ч регидратации, 4 — экстраклеточный раствор, полученный после инкубации и извлечения таллома из раствора регидратации.
A
3.0
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
\
1-1 \
\
! \
i \
\ \
--Феруловая к-та
■РОХ, 1 мин РОХ, 20 мин NADH
/
\ \ /""'/
V.X / \ 4
J_I_I_L_
\
\
\
\ \
_1_I_
0
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
нм
Рис. 2. Спектры поглощения 55 мкМ NADH, 0.1 мМ феруловой кислоты и пероксидазной реакции (РОХ) окисления субстратов: 0.11 мМ NADH и 0.1 мМ феруловой кислоты в 0.73 мкМ натрий-цитратном буфере рН 5.5 в течение 20 мин в присутствии фракции Bj. Скорость сканирования 1920 нм/мин.
ло показано, что ряд лишаиников, мхов, печеночников обладает высокой редокс-активностью, в частности, по образованию супероксидных анион-радикалов (О*-) [6]. Самая высокая активность наблюдалась у одного из видов антоцерото-видных — А. па1а1еш18. Вероятно, это могло быть обусловлено функционированием АФК-образу-ющей пероксидазы.
В настоящей работе показано, что среди исследованных ферментов внутриклеточной фракции А. па1а1еш18 активность пероксидазы наиболее высокая (табл. 1). Кинетический анализ активности пероксидаз в различных фракциях показал, что максимальной скоростью реакции обладают внутриклеточные пероксидазы (табл. 2). Наибольшим сродством к субстрату характеризовались апопластные пероксидазы, поскольку они
Таблица 1. Активность ферментов внутриклеточной фракции А. па1а1еш18, выраженная в скорости разложения субстрата или образования продукта (Р)
Фермент Активность
S, нмоль/г сух. массы • с
Каталаза 10.6 ± 0.3
Аскорбатоксидаза 44.0 ± 4.9
Аскорбатпероксидаза 50.5 ± 4.1
P, нмоль/г сух. массы • с
ДОФА-оксидаза (тирозиназа) 114.6 ± 9.9
ДОФА-пероксидаза 129.0 ± 8.8
Пероксидаза 3314.8 ± 366.5
имели наименьшую константу Михаэлиса (табл. 2). Таким образом, для активации пероксидаз апо-пласта достаточно небольшое количество субстрата. Это обстоятельство может иметь важное значение для индукции окислительного взрыва на клеточной поверхности при стрессе, запуска сигнальных каскадов и последующего формирования иммунитета у растений [12].
Известно, что пероксидаза обладает NADH-ок-сидазной функцией, при этом в результате взаимодействия этого фермента с кислородом образуются радикальная форма NAD и H2O2 [13]. Согласно схеме Чанса, в присутствии H2O2 и восстановителя пероксидаза способна также к образованию O^- . Ранее нами было показано, что феруловая кислота может быть одним из субстратов пероксидазы при образовании АФК [7]. В настоящей работе показано, что в присутствии NADH и феруловой кислоты и в отсутствие экзогенной H2O2 наибольшее падение оптической плотности наблюдается в области 314 нм, что, вероятно, обусловлено окислением феруловой кислоты, а не NADH (рис. 2). Реакция в значительной степени подавлялась цианидом на 63.3, 32.8, 79.9 и 89.9% во фракциях C, Bj, B2, B3 соответственно, что косвенно подтверждает вовлечение в этот процесс пероксидаз.
Вероятно, при взаимодействии пероксидаз ан-тоцероса с NADH образуется эндогенная H2O2. Известно, что при совместном окислении субстратов пероксидазы с резко различающейся реакционной способностью наблюдаются эффекты взаимной активации или ингибирования [14].
3
4
ПЕРОКСИДАЗЫ ANTHOCEROS NATALENSIS
237
Таблица 2. Максимальная скорость ( Vmax) и константа Михаэлиса (KM) реакции окисления о-дианизидина пероксидазами A. natalensis
Фракция Vnax, нмоль/г сух. массы, с KM, мМ
C 4163 0.20
B1 674 0.12
B2 732 0.14
B3 344 0.13
Примечание. С - внутриклеточная фракция. Фракции белков, связанных с клеточной стенкой: водородными связями (В1), ван-дер-ваальсовыми силами и гидрофобными взаимодействиями (В2), ионными связями (В3).
При этом происходит активация окисления медленно окисляемого субстрата и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (активатора) [14, 15]. Возможно, что в наших экспериментах NADH выступал в качестве активатора окисления феруловой кислоты. Поскольку окисление субстратов пероксидазы идет через промежуточные радикальные формы, вероятно, что радикальная форма феруловой кислоты
может приводить к образованию . Предполагается, что фенольные радикалы, окисленные в пероксидазозависимых реакциях, способны к автоокислению с образованием АФК [15]. Таким образом, если предположить, что в стрессовых условиях происходит высвобождение в апопласт NADH или какого-либо другого восстановителя, то для запуска окислительного взрыва потребуется совсем небольшое его количество. В результате дифференцированного окисления субстратов пе-роксидазой такой восстановитель может выступать в качестве индуктора, стимулируя превращение других субстратов, например, фенолов, выделяемых при стрессе в апопласт.
В настоящей работе впервые проанализированы кинетические характеристики пероксидаз ан-тоцеротовидных и выявлен биохимический механизм, подтверждающий их возможное участие в образовании АФК при стрессе посредством субстрат-субстратного взаимодействия. Наши данные демонстрируют, что наряду с известным цитологи-
ческим и морфологическим сходством с сосудистыми растениями антоцеротовидные имеют также определенное сходство особенностей функционирования редокс-ферментов. Можно полагать, что образование АФК пероксидазами — эволюцион-но древний процесс, возникший как защитный механизм с целью повышения иммунитета высших растений, их приспособления к меняющимся условиям среды и успешной колонизации ими различных экологических ниш.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ-ЮАР (№ 11—04—93962) и программы Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ (№ НШ-825.2012.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Villarreal J.C., Car
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.