МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 4, с. 447-458
== ОБЗОР =
УДК 579.8.083.182.2(047):577.323.75
ПЕРСИСТЕНЦИЯ И АДАПТИВНЫЙ МУТАГЕНЕЗ В БИОПЛЕНКАХ © 2010 г. В. К. Плакунов1, Е. А. Стрелкова, М. В. Журина
Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Поступила в редакцию 24.09.2009 г.
В обзоре рассмотрены механизмы формирования клеток-персистеров в планктонных и структурированных популяциях микроорганизмов. Обсуждается связь персистентности и адаптивного мутагенеза. Высказано предположение, что клетки-персистеры являются одним из главных объектов адаптивного мутагенеза и представляют собой инструмент микроэволюционных процессов, происходящих в микробных биопленках.
Процессы формирования биопленок и их основные свойства подробно рассмотрены в недавно опубликованных в нашем журнале обзорах [1, 2], поэтому в данной статье авторы ограничиваются обсуждением только тех аспектов, которые не были достаточно освещены в предыдущих публикациях.
Мы сознательно исключаем из обсуждения биопленки, образуемые эукариотными микроорганизмами, поскольку в связи с особенностями механизмов их формирования эта проблема заслуживает специального детального обсуждения, выходящего за рамки данного обзора.
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОПЛЕНКАХ.
"БИОПЛЕНОЧНЫЙ" ФЕНОТИП
Устойчивость биопленок к внешним воздействиям характеризуют термином "персистенция" (от англ. persistence — выносливость, живучесть). Она во многом обусловлена физиолого-биохимическими свойствами входящих в состав биопленок микроорганизмов, которые фенотипически отличаются от тех же микроорганизмов, существующих в виде планктонных популяций.
Впервые особенности "биопленочного" фенотипа четко сформулировал Костертон, обсуждая различия между планктонными культурами, колониями микроорганизмов и биопленками [3, 4]. В последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в исследовании параметров этого специфического фенотипа как физиолого-биохимическими, так и молекулярно-биологическими методами. Эти результаты изложены в недавно опубликованных обзорах и монографиях, например, [5, 6]. Мы ограничимся лишь теми сведениями, которые представляют интерес для темы данного обзора.
Биопленочный фенотип создается, главным образом, путем воздействия на культуру микроорга-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi.host.ru).
низмов факторов плотности популяции (quorum sensing, QS) (см. далее), а также в результате взаимного влияния входящих в биопленку организмов.
Ряд механизмов взаимодействия микроорганизмов в биопленках рассмотрен нами в предыдущем обзоре [1].
Однако мы считаем необходимым привести некоторые новые данные, представляющие принципиальный интерес. Учитывая критическую роль микробных биопленок в противостоянии микробных инфекций приемам химиотерапии, большинство таких работ посвящено устойчивости биопленок к антибиотикам.
A priori следует ожидать, что микробные популяции в составе биопленок стратифицированы в пространственном отношении и гетерогенны по физиологическому состоянию (по фазе роста и синтезу продуктов обмена веществ). Однако, если структурную стратификацию можно непосредственно обнаружить оптическими и биохимическими методами, (например, методом FISH, а также по способности к росту анаэробных микроорганизмов в аэробных условиях в составе биопленок, включающих аэробные спутники [7]), то метаболическую гетерогенность обнаружить сложнее, тем не менее именно она во многих случаях может определять персистент-ность биопленок.
В одной из наиболее удачных работ [8], выполненной с биопленками, полученными из Staphylococcus epidermidis, для выявления физиолого-биохи-мической гетерогенности популяции авторы использовали иммунофлуоресцентное определение импульсно меченой ДНК, а также индуцируемый низкими концентрациями тетрациклина зеленый флуоресцентный белок (GFP). В стационарных ко-лониеподобных биопленках зона активного метаболизма располагалась вплоть до глубины проникновения кислорода (до 38 мкм), измеряемого микроэлектродной техникой. Значительная часть клеток микроорганизма в биопленке оказалась метаболически неактивной, но жизнеспособной, поскольку
количество мертвых клеток не превышало 10%. В целом, клетки микроорганизма в биопленке находились в четырех различных состояниях: растущие аэробно, бродящие, мертвые и покоящиеся. К последнему типу, по нашему мнению, могут относиться и клетки-персистеры, роль которых в стабильности биопленок будет рассмотрена в следующих разделах данного обзора. Авторы приходят к выводу, что наличие такой физиолого-биохимической гетерогенности может играть определяющую роль в устойчивости биопленок к антибиотикам. Действительно, клетки находящиеся в разном физиологическом состоянии, могут запускать механизм адаптивного мутагенеза, дополняемый обменом продуктами метаболизма и горизонтальным переносом генетической информации, что активирует микроэволюционные процессы (см. далее), в том числе реализацию механизмов устойчивости к антибиотикам [9, 10].
Неоднократно отмечалось, что мультивидовые биопленки оказываются более стабильными, чем биопленки, построенные из микроорганизмов одного вида. Это объясняется тем обстоятельством, что между компонентами биопленки часто устанавливаются синергидные взаимоотношения. Как правило, такие исследования проводят на бинарных биопленках, поскольку полученные в этих моделях данные легче поддаются интерпретации [11].
Принципиально важные результаты получены в работе [12], в которой показано, что непатогенная бактерия Veillonella parvula при совместном выращивании в составе бинарных биопленок с патогенным Streptococcus mutans изменяет метаболизм последнего таким образом, что S. mutans становится значительно более устойчивым к различным антибактериальным агентам. Хотя механизм этого явления остается неизвестным, авторы приходят к важному выводу о необходимости подбора химиотерапевти-ческих средств, активных не только против индивидуального патогена, но и против микробного сообщества, в которое он входит.
Особый аспект проблемы представляет изучение влияния микроорганизмов-спутников (диссипо-трофов) на микроорганизмы "продуценты" в условиях голодания, как это имеет место в тех экотопах, где исходные источники углерода и энергии доступны лишь ограниченному числу компонентов микробиоценоза ("продуцентам").
Это, в частности, относится к призабойным зонам заводняемых нефтяных месторождений, где единственным источником углерода и энергии являются компоненты нефти. В этом случае обнаружено повышение скорости и полноты утилизации гексадекана в бинарной биопленке, включающей нефтеокисляющие бактерии и их спутники, неспособные к утилизации парафинов. Таким способом спутник противодействует стрессу голодания путем стимуляции образования продуктов расщепления
углеводородов [13, 14]. Возможен и другой способ стимуляции активности продуцента-нефтеокисли-теля, осуществляющийся в условиях повышенной солености пластовых вод. В этом случае формирование бинарной биопленки из нефтеокисляющего микроорганизма и его галофильного спутника, неспособного к утилизации нефти, приводит к повышению в клетках спутника-галофила экспрессии метаболического пути биосинтеза осмопротектора эктоина, выделяемого наружу и поглощаемого неф-теокислителем, в результате чего галофил защищает нефтеокисляющий микроорганизм от осмотического шока [15].
Еще одним особым механизмом устойчивости биопленок является формирование в них клеток-персистеров.
УСТОЙЧИВОСТЬ БИОПЛЕНОК К СТРЕССОВЫМ ФАКТОРАМ И АНТИМИКРОБНЫМ АГЕНТАМ.
КЛЕТКИ-ПЕРСИСТЕРЫ
Одним из удивительных явлений, характерных для биопленок, является наличие в них т.н. "кле-ток-персистеров", устойчивых к воздействию как агрессивных факторов среды, так и антимикробных агентов.
Феномен персистентности (persistence), т.е. генетически ненаследуемого (фенотипического) свойства небольшой части бактериальной популяции сохранять жизнеспособность даже в присутствии летальных доз пенициллина, был открыт на заре "эры антибиотиков" [16] и неоднократно подтвержден рядом исследователей [17, 18]. Как нами было показано, он проявляется, в частности, в том, что в присутствии "бактериостатических" концентраций антибиотиков-ингибиторов белкового синтеза образование некоторых белков, особенно компонентов цитоплазматической мембраны, продолжается, хотя и со сниженной скоростью [19, 20]. Одновременно наблюдается медленное возрастание оптической плотности популяции бактерий за счет роста части клеток [21].
Феномен персистентности следует отличать от другого генетически ненаследуемого феномена "нейтральности" (indifference), проявляющегося во всей популяции микроорганизмов и обусловленного тем, что медленно растущие (или покоящиеся) клетки, как правило, обладают сниженной чувствительностью к антибактериальным агентам. Классическим примером является нечувствительность покоящихся клеток бактерий к пенициллину и другим ингибиторам биосинтеза клеточной стенки [22, 23].
Механизму персистентности посвящено большое количество исследований (сотни экспериментальных работ и десятки обзоров), поскольку этот феномен играет чрезвычайно важную роль в повторяющихся (хронических) микробных инфекциях. В
этих случаях лечение антибиотиками уничтожает в макроорганизме подавляющее большинство сво-бодноживущих (планктонных) клеток патогена, а также значительную часть чувствительных клеток патогена в биопленках. Иммунная система расправляется с остатком планктонных клеток-персисте-ров. Однако клетки-персистеры, локализованные в биопленках, недоступны для иммунной системы и после прекращения антибиотикотерапии возобновляют размножение, вызывая повторную вспышку инфекционного процесса.
По данным Центра контроля заболеваний (CDC, USA), около 65% всех инфекций обусловлено формированием в макроорганизме биопленок [24]. Кроме того, биопленки образуются практически на всех внедряемых в макроорганизм медицинских устройствах: катетерах, протезах и т.д. Поэтому понятна важность проблемы персистентности для медицины. Однако существенное значение имеет эта проблема
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.