БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ =
УДК 577.3
ПЕРСПЕКТИВЫ И СПОЛЬЗОВАНИЯ ГАЗОВ И ГАЗОВЫХ ГИДРАТОВ В КРИОКОНСЕРВАЦИИ
© 2015 г. Н.В. Шишова, Е.Е. Фесенко (мл.)
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3 E-mail: eugeny.ef@gmail.com, сгуорге$етаПоп@и$1.гы Поступила в p едакцию 23.07.15 г.
В обзоре предпринята попытка оценить известные свойства газогидратов и образующих их газов с точки зрения механизмов криоповреждений и криозащиты, рассмотреть работы по замораживанию биологического материала в присутствии инертных газов и проанализировать перспективы развития этого направления. Для этого проведен поиск информации по физическим свойствам газов и газогидратов, проведено сопоставление процессов, протекающих при образовании газовых гидратов и водного льда, проанализировано влияние образования и роста газовых гидратов на структуру биологических объектов. Сделан краткий обзор биологического действия ксенона, криптона, аргона, углекислого газа, сероводорода, угарного газа с акцентом на гипотермические условия и возможное применение данных свойств в технологиях крио-консервации. П роанализированы описания существующих экспериментов по криоконсервации биологических объектов с применением газов. На основании найденной информации обозначены наиболее перспективные направления работ в области криоконсервации биологических объектов с применением газов и сделана попытка прогнозирования потенциальных проблем в этой области.
Ключевые слова: криоконсервация, витрификация, гипотермия, газогидраты, клатраты, инертные газы, ксенон, криптон, аргон.
Технологии хр анения жизнеспособного биологического материала в глубокозамор оженном состоянии (температура -80°С и ниже), т.е. технологии криоконсервации, зародились в середине прошлого века [1-3]. С тех пор методы криоконсервации активно р азвивались и в настоящее время широко применяются в науке, медицине, сельском хозяйстве и биотехнологических производствах. Наряду с успехами в этой области, до сих пор остается нерешенным вопрос криоконсервации крупных объектов -органов и больших массивов тканей. Хранение такого материала является актуальной проблемой в связи с р азвитием методов трансплантации тканей и органов и, соответственно, необходимостью создания запаса трансплантатов в криобанках.
В рамках поиска новых направлений для дальнейшего развития технологий криоконсервации в конце 60-х годов прошлого века возникла идея применения газовых гидратов для криоконсервации биообъектов. В 1969-м г. Р. Прегода теоретически обосновал возможность использования инертных газов в качестве криопротекторов [4]. Благодаря малому размеру молекул, инертные газы свободно проникают через мембраны клеток и при этом не под-
вергаются какой-либо биотрансформации, поскольку не вступают в химические реакции. Таким образом, теоретически решаются основные проблемы криоконсервации крупных объектов: 1) вместо кристаллов льда формируются кристаллы газовых гидратов; 2) инертные газы заполняют весь объем органа; 3) инертные газы не токсичны.
Однако образование газогидратов как подход к криоконсервации до сих пор практически не исследован. Количество публикаций, посвященных криоконсервации с использованием газов, способных к образованию стабильных газогидр атов, ограничено.
В настоящем обзоре мы попытались оценить известные свойства газогидратов и образующих их газов с точки зрения механизмов криоповре-ждений и криозащиты, рассмотреть работы по замораживанию биологического материала в присутствии инертных газов и проанализировать перспективы р азвития этого направления.
КЛАТРАТООБРАЗУЮЩИЕ ГАЗЫ И ГАЗОГИДРАТЫ
Ряд газов - Лг, Кг, Хе, СН4, С02, С2Н6, ^ - при низкой температуре и повышенном
Таблица 1. Растворимость некоторых газов в воде и жирах при температуре 37°С [9]
Газ Коэффициент р астворимости Оствальда, мл/мл Соотношение р астворимости вода/жир
в воде в жирах
Кислород 0,029 0,120 4,1
Двуокись углерода 0,57 1,28 2,2
Аргон 0,026 0,140 5,3
Криптон 0,045 0,43 9,6
Ксенон 0,085 1,7 20,0
давлении способны образовывать гидраты, представляющие собой кр исталлические структур ы, напоминающие лед, но по своим физическим свойствам значительно отличающиеся от него. Суть газогидратного подхода к кр ио-консервации состоит в том, чтобы при замораживании биоматериала заместить процесс образования кристаллов льда на процесс образования кристаллов газовых гидратов. П ри этом наиболее перспективным гидратообразующим газом является ксенон, поскольку в ряду Лг-Кг-Хе газогидраты ксенона отличаются наибольшей стабильностью и образуются при околонулевой температуре и давлении порядка 1,5 атм (также для ксенона показан опыт медицинского применения; в Ро ссии активно развивается техника ксенонового наркоза). В то же время в качестве криопротектирующих агентов рассматриваются и другие газы: аргон и криптон. Обобщенно аргон, криптон и ксенон объединяют под названием тяжелых нерадиоактивных инертных газов.
Физические свойства тяжелых нерадиоактивных инертных газов. Растворимость в воде, жирах и биологических структурах. Влияние криопротекторов на растворимость. Газовые гидраты составляют большой класс клатратных (от латинского с1а1гаШ8 - защищенный решеткой) соединений, которые представляют собой объемную решетку, образованную молекулами воды, полости которой заполнены молекулами газа. По внешнему виду газовые гидраты напоминают снег или рыхлый лед. К гидратооб-разованию способны газы, диаметр молекул которых находится в интервале 0,38-0,92 нм. К ним относятся метан, этан, пропан, азот, сероводород, углекислый газ, кислород, аргон, криптон, ксенон. Не образуют газовых гидратов (либо образуют при сверхвысоких давлениях) водород, неон, гелий, а также углеводороды, содержащие свыше пяти атомов углерода. Газовые гидраты устойчивы при пониженной температуре и повышенном давлении. При околонулевой температур е и давлении до трех атмосфер могут существовать газогидраты ксенона,
пропана, сероводорода. В качестве наиболее перспективного газа-криопротектора чаще всего рассматривают ксенон [5-7] или аргон-крип-тон-ксеноновую смесь [8].
Все тяжелые нерадиоактивные инертные газы обладают достаточно хор ошей растворимостью в воде и еще лучшей растворимостью в гидрофобных растворителях (см. табл. 1). По уточненным данным значение растворимости ксенона (коэффициент Оствальда) в воде соответствует диапазону от 0,096 до 0,098 мл/мл [10].
Биологические жидкости содержат множество примесей, способных оказывать влияние на растворимость газов. Например, соли, со -держащиеся в биологических жидкостях и тканях, обладают способностью понижать растворимость газов. Липиды, являясь хорошими растворителями для инертных газов, напротив, будут повышать растворимость инертных газов в жидкости. Помимо липидов, ксенон и кр иптон проявляют сродство к гидрофобным центрам белков, что также должно оказывать влияние на растворимость данных газов. В табл. 2 представлены коэффициенты растворимости ксено -на и криптона для ряда биологических веществ, жидкостей и тканей. Для количественной характеристики раствор имости газов используется коэффициент растворимости Оствальда, определяемый как отношение объема растворенного в жидкости газа (Уг) к объему абсорбирующей его жидкости (Уж), измеренных при температуре эксперимента.
Обращает на себя внимание тот факт, что растворимость ксенона в ткани печени с высо -ким содержанием липидов превышает растворимость ксенона в оливковом и парафиновых маслах и лишь немного ниже растворимости в лецитине. Это может свидетельствовать о том, что биологические ткани обладают дополнительными, помимо липидов, сайтами, обладающими высоким сродством к ксенону. Известно, что ксенон и криптон проявляют высокое сродство к гидрофобным центрам некоторых ферментов [14,15]. Из этого факта можно было бы
Таблица 2. Растворимость ксенона и криптона (коэффициент Оствальда) в биологических жидкостях и тканях при 37°С
Жидкость, ткань Коэффициент р аствор имости О ствальда, мл/мл Ссылка
криптон ксенон
Дистиллированная вода 0,0481 0,0830 [11]
Р а створ 0,9% МаС1 0,0458 0,0780 [11]
Оливковое масло 0,451 1,883 [11]
Пар афиновое масло 0,481-0,492 2,065-2,079 [11]
Лецитин 0,367 4,767 [11]
Плазма кр ови 0,0494-0,0502 0,0942-0,0953 [11]
Красные кровяные тельца 0,0718 0,1966 [11]
Р а створ гемоглобина (липиды 2,5 мг/мл, НЬ 15,4%) 0,042 0,1241 [12]
Р а створ гемоглобина (липиды 1,6 мг/мл, НЬ 7,5%) 0,044 0,1046 [12]
К р овь человека (липиды 5,5%, НЬ 14%) 0,045 0,141 [12]
Ткань печени (липиды 3%) 0,050-0,075 1,1-1,8 [13]
Ткань печени (липиды 15%) 1,1 3,8-3,9 [13]
сделать заключение о связывании этих газов белками. Однако р а створ имость ксенона в плазме кр ови, содер жащей около 7-8% белков, лишь немного пр евышает раствор имость в физиоло -гическом растворе солей. Можно сделать заключение, что ткани могут иметь дополнительные, неизвестные нам области, удер живающие ксенон и кр иптон.
Процесс подготовки биообъектов к крио-консер вации пр отекает пр и темпер атур ах ниже физиологической. Соответственно насыщение тканей газами в процессе подготовки объекта к замораживанию необходимо проводить при пониженных относительно физиологической темпер атур ах. X о р ошо известно, что раствор и-мость газов в воде и водных р аствор ах повышается пр и понижении темпер атур ы. И сследо-вания р аствор имости ксенона и кр иптона в растворе альбумина и гомогенате некоторых животных тканей пр и темпер атур ах от 25 до 37°С свидетельствуют, что зависимость раствор имо сти этих газов от темпер атур ы в биологических жидко стях подчиняется тем же зако -номер но стям [12]. Влияние темпер атур ы на ра створ имость ксенона и кр иптона в биологических жидкостях в более широком диапазоне темпер атур было исследовано в р аботах [10,16,17]. В качестве модельных биологических жидкостей были выбраны жировые эмульсии (молоко с жир ностью 2,5%, сливки с жир ностью 10 и 22%). На рис. 1 и 2 показаны зависимости коэффициента р аствор имости О ствальда от температуры для воды, жировых эмульсий и масла.
Растворимость ксенона при охлажден
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.