ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 93, № 4, с. 521-526
УДК 595.124
ПЕРВАЯ НАХОДКА ПРЕСНОВОДНЫХ НЕМЕРТИН В ОЗЕРЕ ОХРИД (МАКЕДОНИЯ) С НЕКОТОРЫМИ ЗАМЕЧАНИЯМИ О СИСТЕМАТИКЕ РОДА PROSTOMA (NEMERTEA, MONOSTILIFERA)
© 2014 г. А. Г. Королева1, А. В. Чернышев2,3, С. В. Кирильчик1, О. Тасевска4, Г. Костоски4, О. А. Тимошкин1
1Лимнологический институт СО РАН, Иркутск 664033, Россия 2Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 690059, Россия 3Дальневосточный федеральный университет, Владивосток 690600, Россия 4JHY Хидробиолошки завод Охрид, Наум Охридски, 50, 6000, Охрид, Македония
e-mail: takonedo.bb@mail.ru Поступила в редакцию 11.10.2012 г.
В реликтовом оз. Охрид впервые обнаружены пресноводные немертины из рода Prostoma (Duges 1828). Проведен генетический анализ фрагмента гена CO1, который показал конспецифичность Prostoma из озера Охрид с широко распространенным видом P. graecense (Bohmig 1892). Высказано предположение, что P. graecense и P. eilhardi (Montgomery 1894) могут принадлежать к одному виду, за которым следует сохранить название Prostoma clepsinoides Duges 1828 (типовой вид рода Prostoma). Данные молекулярно-филогенетических построений поддерживают самостоятельность семейства Prostomatidae.
Ключевые слова: пресноводные немертины, Prostoma, ген CO1, Prostomatidae, озеро Охрид. DOI: 10.7868/S0044513414040060
Prostoma — единственный не монотипический род пресноводных немертин, представители которого (прежде всего, два космополитных вида — P. graecense (Bohmig 1892) и P. eilhardi (Montgomery 1894)) широко распространены на всех континентах, исключая Антарктиду. Несмотря на широкое распространение, виды рода встречаются очень спорадически и до сих пор неизвестны в некоторых крупных водоемах — например, в таких озерах как Ладожское и Байкал. Не были они известны и в древнем оз. Охрид, которое характеризуется богатой эндемичной фауной (Stankovic, 1960; Albrecht, Wilke, 2008). В 2009 г. одним из соавторов статьи (Тимошкин О.А.) в ходе экспедиционных работ на озере Охрид было собрано несколько экземпляров немертин, которые по всем признакам относятся к роду Prostoma. Ввиду того, что морфологические различия между некоторыми видами рода Prostoma очень незначительны, а их точная видовая идентификация нередко бывает затруднительной, нами был предпринят моле-кулярно-генетический анализ трех особей. Обсуждению полученных данных и посвящена настоящая статья.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Все черви (6 особей) были обнаружены 16 сентября 2009 г., под скалой, на которой расположен монастырь Святой Наум (северная оконечность озера), в нескольких десятках метров от границы с Албанией. Как и простомы из оз. Бива (Chernyshev et al., 1998), охридские Prostoma обитают среди плотных дерновинок макрофитов, на каменистом грунте (глубина около 0.6 м). Все особи были сфотографированы и зафиксированы 80% этанолом.
Три особи были отправлены во Владивосток и хранятся в коллекции музея Дальневосточного федерального университета.
ДНК была выделена методом стандартной фенол-хлороформной экстракции (Sambrook, 1989) с некоторыми модификациями. Ткани гомогенизировали в TE буфере и добавляли SDS и протеи-назу К (SIGMA) до концентрации 2% и 0.1 мг/мл, соответственно, и инкубировали при 60°С в течение 2 ч. Далее проводили экстракцию равным объемом фенола и хлороформа, центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость, снова экстрагировали хлороформом, центрифугировали и осаждали 0.1 объемом 3М ацетата натрия и 2 объ-
522
КОРОЛЕВА и др.
Материал, использованный для анализа ДНК
Вид рода Prostoma Местонахождение CO1 (№ GenBank)
P. graecense (ochr) оз. Охрид JX017298.1
P. graecense Новая Зеландия AY928355.1
P. graecense Швеция AY928356.1
P. cf. eilhardi США HQ848594.1
емами 96% этанола. После осаждения ДНК промывали 70% этанолом и растворяли в воде.
ПЦР проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1-кратный буфер для реакции, 2.5 мМ хлорида магния, 0.2 мМ каждого dNTP, 1 пмоль каждого праймера, 10—50 нг тотальной ДНК и 0.1—0.2 единиц активности Taq-полимера-зы. Амплификацию осуществляли 35-кратным повторением стадий в следующей последовательности: 94°С - 20 с, 50°С - 20 с и 72°С - 60 с. Для амплификации фрагмента митохондриального гена CO1 использовали праймеры 5'-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3' (прямой) и 5'-TAAACTTCAGGGTGACCA AAAAATCA-3' (обратный) (Folmer, 1994).
ПЦР-продукты разделяли в 0.7%-ном агароз-ном геле в 1-кратном трис-ацетатном буфере (pH = 7.6) и выделяли из геля с использованием колонок и реагентов набора компании GE Healthcare. Очищенные образцы секвенировали в обоих направлениях с теми же праймерами согласно протокола BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) на автоматическом секвенаторе ABI 3130xl. Анализ продуктов реакции Сэнгера проводили в ЦКП "Геномика" СО РАН.
Для построения филогенетических схем использовались полученные нами нуклеотидные последовательности участка гена CO1 для охрид-ских образцов Prostoma и последовательности того же гена, взятые из базы данных GenBank других представителей этого рода (таблица). Кроме видов рода Prostoma, были использованы последовательности видов из родов Tetrastemma Ehrenberg 1828, Oerstedia Quatrefages 1846, Prosorhochmus Keferstein 1862, Cyanophthalma Norenburg, 1986 и др. (данные также взяты из GenBank). Выравнивание нуклеотидных последовательностей обоих генов осуществлялось в программе ClustalW1.6 (Thompson, 1994) и корректировалось вручную. Реконструкция дерева осуществлялась в программе MrBayes (3.1.2) (Huelsenbeck, 2001) при использовании модели GTR с гамма-распределением скорости замен (G) и учетом инвариантных сайтов (I) на основе критерия Байеса и метода максимального правдоподобия. Цепи Маркова (MCMC) рассчитывались в течение 10000000 поколений (4 цепи параллельно) с частотой записи
параметров каждые 100 поколений. Первые 2500000 поколений использовались для стабилизации метода правдоподобия, а остальные — для оценки апостериорной вероятности. Критерием достоверности служила апостериорная вероятность, превышающая 95%. Также реконструкция деревьев проводилась в пакете программ MEGA (4.0.2), где использовались метод ближайших соседей (Neighbor-Joining) и модель Кимура-2-па-раметра с дополнительным бутстреп анализом (1000 репликаций). С помощью обоих методов (максимального правдоподобия и ближайших соседей) были получены деревья схожей топологии.
РЕЗУЛЬТАТЫ Внешняя морфология
Длина живых червей составляла 10—12 мм, ширина 0.5—0.7 мм (рис. 1). Окраска тела варьировала от молочно-белой до желто-оранжевой и розоватой. Голова не отграничена от туловища. На голове 4 темных глаза; по меньшей мере, у одной особи имелось два дополнительных глазка.
Длина ринхоцеля около % длины тела. Иногда простомы образуют подобие чехликов из фрагментов макрофитов и слизи.
Анализ последовательностей фрагмента гена СО1
Длина анализируемых последовательностей после выравнивания составила 527 пн, при этом 87 сайтов были филогенетически информативными. Сравнение фрагментов гена СО1 выявило высокую степень гомологии последовательностей охридского образца и P. graecense (1 замена, гомология 99.81%), а также первого и P. eilhardi (5 замен, гомология 99.05%). При сравнении с другими родами наблюдались следующие различия: 4% (21 замена) с Oerstedia, 9% (49 замен) с Prosorhochmus, 13% (70 замен) с Cyanophthalma и до 18% (72—98 замен) с Tetrastemma (рис. 2). Считается, что скорость мутирования митохондриальной ДНК (мтДНК) превышает таковую ядерной ДНК в 5—10 раз (Brown, 1979). Это позволяет разрешать некоторые филогенетические отношения на уровне популяций и близких видов. Однако процент гомологии при сравнении митохондриаль-ных генов может сильно варьировать у разных организмов (Galtier, 2009). В нашем случае высокая степень гомологии последовательностей СО1 для анализируемых Prostoma из разных географических локаций позволяет говорить об очень близких родственных отношениях между ними, вплоть до отнесения их к одному виду.
ПЕРВАЯ НАХОДКА ПРЕСНОВОДНЫХ НЕМЕРТИН В ОЗЕРЕ ОХРИД
523
ОБСУЖДЕНИЕ
Род Prostoma насчитывает 10-11 валидных видов (Chernyshev et al., 1998). После ревизии простом, проведенной Гибсоном и Мур (Gibson, Moore, 1976), точная видовая диагностика стала возможной только на основе изучения внутренней морфологии переднего конца тела на серийных гистологических срезах. Однако некоторые признаки, используемые для разграничения видов, нельзя считать надежными, и они нуждаются в оценке внутривидовой изменчивости. К их числу следует отнести размеры головных желез, отсутствие или наличие короткого пищевода, а также мускульной стенки ринходеума. Например, для некоторых вооруженных немертин показано, что при сильном сжатии червей в процессе фиксации пищевод может становиться неразличимым (Envall, Sundberg, 1993; Чернышев, 2011). Два широко распространенных вида Prostoma (P. graecense и P. eilhardi) различаются только по перечисленным выше признакам, при этом следует учесть, что описаны "промежуточные" в морфологическом плане виды (P. ohmiense Chernyshev, Timoskin, Kawakatsu 1998 и P. macrode-num Sun et Yin 1995). Совершенно очевидно, что дальнейшая ревизия рода возможна только с привлечением молекулярно-генетических методов. Это особенно актуально, учитывая чрезвычайно широкое распространение P. graecense и P. eilhar-di. Как было показано ранее (Strand, Sundberg, 2005), генетические различия между экземплярами P. graecense из Новой Зеландии и Швеции не превышали 3% при анализе митохондриального гена СО1 и 0.15% при анализе ядерного гена 18S рРНК. Проведенное нами сравнение нуклеотид-ных последовательностей CO1 простомы из Охрида и последовательностей из GenBank (рис. 2) показало, что все исследуемые виды простом, в том числе Prostoma из оз. Охрид, имеют очень близкое родство, т.к. различия в этом фрагменте гена не превышают 1%. Это может означать, что изученные нами образцы из Охрида принадлежат к широко распространенному виду P. graecense. Однако также не было выявлено существенных различий между P. graecense и P. cf. eilhardi, и это
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.