БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 9, с. 691 - 694
УДК 577.212.3.577.217.343'112
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЛОКАЛИЗАЦИЯ НА ХРОМОСОМАХ
© 1995 г. А. В. Кочетов#, В. В. Лукашева, М. Л. Филипенко*, Н. П. Мертвецов*, М. И. Ривкин
Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 10; * Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8 Поступила в редакцию 27.10.94 г. После доработки 14.03.95 г.
] Га основании известной первичной структуры гена панкреатической рибонуклеазы мыши выбраны два дезоксирибоолигонуклеотида в качестве праймеров для амплификации гена панкреатической рибонуклеазы человека. Проведено клонирование полученного в результате полимераз-ной цепной реакции фрагмента ДНК и определена его нуклеотидная последовательность. Осуществлена локализация гена панкреатической рибонуклеазы на хромосоме 14 человека.
Ключевые слова: панкреатическая рибонуклеаза\ полимеразная цепная реакция; гены, картирование.
Панкреатические рибонуклеазы представляют собой группу гомологичных белков, которые в значительных количествах производятся и сек-ретируются экзокринными клетками поджелудочной железы млекопитающих. Рибонуклеазы благодаря небольшой величине, доступности и высокой стабильности представляют собой весьма удобные модели для исследования структуры белка и являются объектом интенсивного изучения. В настоящее время определены аминокислотные последовательности и охарактеризованы свойства около 50 представителей семейства панкреатических рибонуклеаз [1]. Исследованы структуры генов панкреатических рибонуклеаз мыши и быка. Показано, что кодирующие области этих генов не содержат интронов и определяют синтез белков-предшественников размером 150 а. о. [2,3]. Аминокислотная последовательность рибонуклеазы человека была опубликована в 1984 г. [4], однако структура гена до сих пор не изучена. В данной работе определена структура кодирующей области гена панкреатической рибонуклеазы человека и проведено картирование гена панкреатической рибонуклеазы на хромосомах человека.
На основании данных об отсутствии интронов в белоккодирующих районах генов рибонуклеаз мыши и быка [2, 31 было сделано предположение, что кодирующая область гена панкреатической рибонуклеазы человека также не содержит ин-
# Автор для переписки. Факс: (3832) 356558; E-mail: Riv-kin@cgi.nsk.su.
тронов. Это позволило применить для клонирования кодирующей последовательности гена метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве матрицы геномную ДНК человека.
В результате анализа известной нуклеотидной последовательности гена панкреатической рибонуклеазы мыши [3] мы выбрали и синтезировали два дезоксирибоолигонуклеотида - Р1 (отвечающий участкам кодирующей части гена от + 865-го до + 894-го нуклеотида) и Р2 (гомологичный участку кодирующей части гена от + 1301-го до + 1318-го нуклеотида), которые использовали в качестве праймеров для амплификации:
Р15'АССАТСООТСТООАОААОТС
и Р25 ССТАСАСАвТАССАТСАА.
Среди продуктов амплификации на плацентарной геномной ДНК человека был обнаружен фрагмент длиной около 460 п. о., соответствующий величине, предсказанной для искомого гена на основании анализа известных первичных структур генов панкреатических рибонуклеаз мыши и быка [2, 3]. Фрагмент выделяли из геля и лигиро-вали с линеаризованной эндонуклеазой ЕсоКУ плазмидой рВЬдевспр! БК. Анализ плазмидной ДНК из клонов, дефектных по 1асХ-системе, проводили с помощью рестриктазы РуиП (результаты не показаны). Нуклеотидная последовательность вставок из трех независимых клонов была определена модифицированным методом Сэн-гера [5] (рис. 1). Все три структуры оказались полностью идентичными.
691
3*
праймер (Р2)
5') Leu Va 1 Ar g Leu Leu Leu Leu Va 1 Leu
с с a t g ;gg t с t ggag a a g t с t с t t g t с cgg с t с с t t с t g с t t g t с с t g
I 1 е Leu Leu Va 1 Leu G1 y Trp Va 1 Gln Pro Ser Leu G 1 y
a t а с t g с t g g t g с t g ggc tgg g t с cag с с t t с с с t g ggc
1 10
Ly s G1 u Ser Arg Al a Ly s Ly s Phe Gln Ar g Gln Hi s Me t
a ag gaa t с с cgg gee aag a a a t t с cag cgg cag с a t at g
20 ( 5' ) —( P89 )-
Asp Ser Asp Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Cys
gac t с a gac ag t t с с с с с age age age t с с а с с t а с tgt
30
As n Gln Me t Me t Arg Arg Arg As n Me t Thr Gln G1 y Arg
аас с a a a t g a t g agg cgc cgg a a t a t g аса cag ggg cgg
40 50
Су s Ly s Pro Va 1 As n Thr Phe Va 1 Hi s G1 u Pro Leu Va 1
t ge a a a cea gtg а а с а с с t t t gtg cae gag с с с с tg g t a
60
As p Va 1 Gln As n Va 1 Су s Phe Gln G1 u Ly s Va 1 Thr Cy s
ga t g t с cag a a t g t с tgt t t с cag gaa aag g t с а с с t ge
70
Ly s As n G1 y Gln G1 y As n Cys Tyr Ly s Ser As n Ser Ser
aag а а с ggg cag ggc aac t ge tac aag age aac t с с age
80 90
Me t Hi s I 1 e Thr Asp Cys Arg Leu Thr As n G1 y Ser Arg
a t g с а с ate аса gac t ge cgc с t g аса aac ggc t с с agg
100 ( P 90 ) -
Ту r Pro As n Су s Al a Tyr Arg Thr Ser Pro Ly s G1 u Arg
tac с с с а а с tgt gca t а с cgg асе age с cg aag gag aga
— ( 5') 110
Hi s I 1 e I 1 e Va 1 Al a Cys G1 u G1 y Ser Pro Tyr Va 1 Pro
cae ate a t t gtg ge с tgt gaa ggg age cea t a t gtg с с a
119
Va 1 Hi s
g t с с а с t
аас t accat gacacat сс( 5') праймер (Р2)
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность кодирующей части гена панкреатической рибонуклеазы человека и соответствующая ей аминокислотная последовательность. Аминокислотные остатки последовательности зрелого белка пронумерованы. Фрагменты ДНК, соответствующие праймерам Р1, Р2, Р89, Р90, подчеркнуты.
Нуклеотидная последовательность гена панкреатической рибонуклеазы человека была зарегистрирована нами в банке данных EMBL (код Х79235). Аминокислотная последовательность, полученная на основе данных о нуклеотидной последовательности кодирующей части reirá, включает последовательность зрелого белка рибонуклеазы человека (за исключением восьми С-концевых аминокислот) и соответствует опубликованным ранее данным о структуре этого белка (рис. 1) [4]. N-Концевой фрагмент данной аминокислотной последовательности (в силу особенностей клонирования его структура также определена не полностью), возможно, выполняет роль лидерного пептида.
Для картирования гена рибонуклеазы на хромосомах человека в качестве праймеров для амплификации внутреннего фрагмента этого гена размером 250 п. о. были выбраны два дезоксири-боолигонуклеотида:
Р89 5 САТАГССАСТСАОАСА и Р90 5 С'ГАССТСОАОССОТТТ.
Праймеры соответствовали участкам гена рибонуклеазы человека, не имеющим выраженной гомологии с геном рибонуклеазы мыши, и были использованы для амплификации на ДНК гибридных клонов грызун х человек, несущих разные хромосомы человека. Из рис. 2 видно, что при использовании выбранных нами параметров
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА
693
ПЦР происходит специфическая амплификация фрагмента гена панкреатической рибонуклеазы человека.
Хромосомный состав гибридных клеток, а также результаты амплификации приведены в таблице. Наличие амплифицируемого фрагмента при анализе продуктов ПЦР строго коррелировало с присутствием в гибридных клетках хромосомы 14 человека. Следует отметить, что ген рибонуклеазы мыши локализован на 14-й хромосоме в сегменте, гомологичном сегменту 14ql 1 14-й хромосомы человека [6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали бактериальный штамм Е. coli XLl-Blue {rec AI, endAl, gyrA96, thi-1, hsdRll, supE44, re/Al, [F, pro AB, lacP lacZ M15, TrüO(tetr)], а также 7ад-ДНК-полимеразу, ДНК-лигазу фага Т4, эндонуклеазы рестрикции EcoRV и PvhII, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli, 5 -бром-3-ин дол ил-£)-га л а ктозид (Biopol, Москва), [а-32Р]АТР с уд. акт. 40 Пбк/моль ("Радиопрепарат", Ташкент). Олигодезоксирибонуклео-тидные праймеры были синтезированы В.В. Гор-Ном (НИБХ СО РАН).
Картирующая панель была получена из Coriell Cell Repositories, USA (клоны серии NAO), ДНК из клонов 5L27, 8SM22-2, 6L04, Agl7 была предоставлена Е.В. Копанцевым (ИБХ РАН, Москва).
Полимеразную цепную реакцию проводили на ДНК-амплификаторе "БИС" (пос. Кольцово Новосибирской обл.). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 67 мМ трис-HCl (pH 8.9), 16 мМ (NH)2S04j 1.5 мМ MgCi2, 0.01% Twecn 20, 10 мМ ß-меркаптоэтанол, 100 мкМ dNTP, 1 мкМ праймеры, 2 ед. акт. 7Ъ<?-ДНК-полимеразы, 100 нг геномной ДНК.
Амплификацию проводили в Течение 35 циклов в следующем режиме: денатурация - 94°С, 1 мин; отжиг праймеров - 55°С, 1 мин (для прай-меров PI и Р2) и 62°С, 1 мин (для праймеров РЗ и Р4); полимеризация - 72°С, 1 мин. Полученные амплификационные смеси анализировали электрофорезом в 6% полиакриламидном геле с последующей визуализацией ДНК бромистым эти-дием [7].
Клонирование и секвенированис полученных фрагментов ДНК. Фрагмент ДНК размером около 460 п.о., предсказанным на основании анализа структуры генов панкреатических рибонуклеаз мыши и быка [2, 3], элюировали из геля и клонировали но тупым концам в плазмидный вектор pBluescript SK (Stratagene, USA), гидролизованный рестриктазой EcoRW. Отбор рекомбинантных клонов проводили фенотипически (колонии, дефектные по lacZ-системе) и по анализу ДНК плазмид из этих колоний рестриктазой Pvuïl.
489 404 352
.242 190
147
100
Рис. 2. Электрофорез в 6% ПААГ образцов, полученных в результате амплификации внутреннего фрагмента гена рибонуклеазы человека на геномной ДНК мыши (2), человека (J), на ДНК гибридного клона мышь х человек, несущего 14-ю хромосому человека (4). I - маркеры длины (гидролизат плазмиды PUC19 рестриктазой Mspl; цифры слева - величины фрагментов, п. о.). Стрелкой отмечен фрагмент размером 250 п. о.
Элюцию фрагментов ДНК из геля, выделение плазмидной ДНК, расщепление рестриктазами, сшивку ДНК-лигазой фага Т4, трансформацию клеток Е. coli XLl-Blue и фенотипический отбор
Хромосомный состав гибридных клеток картирующей панели и результаты амплификации фрагмента гена рибонуклеазы н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.