Материалы Общероссийской электронной научной конференции "Актуальные вопросы современной науки и образования" г. Красноярск, ноябрь 2009 г.
ГРНТИ 34 БИОЛОГИЯ
УДК 612.112.015.1+616-074
ПЕРВИЧНЫЕ И ВТОРИЧНЫЕ ГРАНУЛЫ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА И
РАЗЛИЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
А. Г. Михеев, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии А. А. Сидельникова, ассистент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии
Кемеровская государственная медицинская академия г. Кемерово, Россия
С помощью инновационных гематологических фиксаторов и красителей и цитохимических методов исследований в зрелых нейтрофилах человека, псевдоэозинофилах кроликов, морских свинок, белых крыс, кур и черепах обнаружены только вторичные гранулы, а первичные - отсутствовали. Показана зависимость выявления различных цитоплазматических и ядерных структур клеток крови от составов гематологических фиксаторов и красителей.
The goal of the investigation is to study secondary and primary (initial) granules of neutrophils in peripheral blood of a human being and different animals with the help of innovation hematologic fixators and dyes as well with the help of cytochemical methods (cationic proteins, peroxidase, alcaline and acid phosphatase). The biggest secondary granules are found in tortoises, the big ones - in rabbits and chikens, small ones - in guinea-pigs and white rats. Should be noticed that the granules of animals are colored with eosine. The primare granules haven't been found in peripheral blood of neutrophils and pseudoeosinophils of all the objects investigated with the help of morphological and cytochemical methods.
Ключевые слова: зрелые нейтрофилы и псевдоэозинофилы, человек, животные, первичные и вторичные гранулы.
Начиная с 1966 года и по настоящее время, во всех отечественных и зарубежных литературных источниках утверждается, что зрелые нейтрофилы человека и животных содержат в цитоплазме 2 типа гранул: первичные и вторичные. Первичные составляют 1430 %, а вторичные - 70-86 %. Первичные гранулы крупные (0,8 мкм в диаметре), имеют круглую форму и интенсивно окрашиваются азуром в интенсивный вишнево-фиолетовый цвет. Вторичные гранулы очень мелкие и имеют бледную окраску. Проблема морфологии и цитохимии нейтрофилов человека и различных животных до сих пор не решена и является актуальной.
Цель работы - изучить вторичные и первичные гранулы нейтрофилов человека и различных животных с помощью инновационных гематологических фиксаторов, красителей и цитохимических методов.
Материал и методы. Изучали мазки периферической крови, полученные от 50 практически здоровый людей, 30 кроликов, 20 морских свинок, 20 белых крыс, 20 белых мышей, 10 кур и 10 черепах. Для фиксации и окраски препаратов использовали инновационные гематологические фиксаторы и красители, завершение испытаний которых было проведено в 2008 г. Инновационные гематологические фиксаторы и красители представляют собой новое поколение гематологических реагентов, защищенных нами
ранее как авторские свидетельства на изобретения [1,2]. Цитохимическую реакцию на катионные белки проводили с прочным зеленым при рН 8,1. Кислую фосфатазу выявляли методом азосочетания в собственной модификации, опубликованной за рубежом [3]. Цитохимическую реакцию на пероксидазу проводили бензидиновым методом. Щелочную фосфатазу выявляли методом одновременного азосочетания с фосфатом нафтола AS-D и прочным гранатовым GBC.
Результаты исследования. В сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилах человека вторичная зернистость окрашивается совершенно одинаково: очень мелкая, заполняет практически всю цитоплазму, имеет бледную окраску розового цвета. Ни в одном из 500 просмотренных мазков крови человека нам не удалось найти в цитоплазме ни одной первичной гранулы в сегментоядерных (рис.1) и палочкоядерных (рис.2) нейтрофилах.
Шр
Рис. 1. Два сегментоядерных нейтрофила Рис. 2. Палочкоядерный нейтрофил человека. Увеличение 100х10. человека. Увеличение 100х15.
В мазках красного костного мозга человека выявляется большое количество первичных гранул в промиелоцитах. Первичные гранулы под световым микроскопом отличаются крупными размерами, круглой формой и очень интенсивной азурофильной окраской. Если бы первичные гранулы были в цитоплазме зрелых нейтрофилов человека, их легко было обнаружить на фоне очень мелких и бледно окрашенных вторичных гранул. Наши данные свидетельствуют, что в циркулирующих сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилах человека имеются только вторичные гранулы, тогда как первичные отсутствуют.
При цитохимическом выявлении катионных белков в зрелых нейтрофилах человека продукты реакции зеленого цвета очень мелкие, многочисленные, заполняют всю цитоплазму клетки и полностью соответствуют вторичным гранулам. Наличие в цитоплазме зрелых нейтрофилов исключительно мелких гранул, окрашенных прочным зеленым, и отсутствие крупных гранул доказывает наличие в зрелых нейтрофилах человека только вторичных гранул и отсутствие первичных.
Проведение цитохимической реакции на миелопероксидазу в зрелых нейтрофилах человека показало, что продукты окисленного бензидина имеют очень мелкие размеры, коричневый цвет и заполняют всю цитоплазму. Продукты цитохимической реакции на миелопероксидазу по размерам, количеству и расположению в цитоплазме полностью соответствуют вторичным гранулам. Отсутствие крупных отложений окисленного бензидина свидетельствует о том, что в цитоплазме нет первичных гранул.
При цитохимическом выявлении кислой фосфатазы в зрелых нейтрофилах человека отложения азокрасителя пурпурного цвета носят диффузный характер по всей цитоплазме.
1 ^ mj
а®
Vv tf^*
Не обнаружено гранулярных отложений азокрасителя. Отсутствие крупных гранулярных осадков азокрасителя в цитоплазме свидетельствует о том, что в зрелых нейтрофилах человека нет первичных гранул, для которых характерно наличие лизосомальных ферментов.
Щелочная фосфатаза выявляется лишь 35-40 % сегментоядерных нейтрофилов человека, в остальных она отсутствует. Учитывая, что вторичные гранулы имеются в 100 % нейтрофилов и заполняют всю цитоплазму, это свидетельствует об отсутствии щелочной фосфатазы во вторичных гранулах у человека.
В сегментоядерных псевдоэозинофилах кролика вторичные гранулы крупные, имеют правильную круглую форму и интенсивно окрашиваются эозином в красный цвет (рис. 3). Нетрудно подсчитать их количество в одной клетке (от 60 до 85).
Рис. 3. Сегментоядерный псевдоэозинофил кролика (увеличение 100х20).
Ни в одном из 2 тысяч просмотренных мазков крови кролика нам не удалось обнаружить ни одной первичной гранулы. Ранее мы изучали мазки крови десятидневных крольчат, в псевоэозинофилах которых встречались от 2 до 6 первичных гранул, по размерам гораздо крупнее вторичных, имеющих четкие контуры, круглую форму и ярко окрашенных азуром. Из этого следует, что в псевдоэозинофилах кролика сохраняется небольшое количество первичных гранул вскоре после рождения, а в дальнейшем они исчезают.
При цитохимическом выявлении катионного белка в псевдоэозинофилах кролика обнаруживаются гранулы зеленого цвета круглой формы, по размерам и количеству полностью совпадающие с вторичными гранулами. Были подсчитаны окрашенные прочным зеленым гранулы в 30 псевдоэозинофилах. В таком же количестве псевдоэозинофилов были подсчитаны вторичные гранулы. Определяя парный критерий Вилкоксона для сравнения количества гранул при окраске на катионные белки и числа вторичных гранул у одних и тех же животных, мы получили очень высокие показатели критерия Т, подтверждающие несущественность различий между ними. Количество окрашенных прочным зеленым гранул гранул в одном псевдоэозинофиле практически совпадало с числом вторичных гранул. Это доказывает локализацию катионного белка исключительно во вторичных гранулах псевдоэозинофилов у кролика.
Продукты цитохимической реакции на миелопероксидазу имеют темно-коричневую окраску, круглую форму, по размерам и количеству соответствуют вторичным гранулам. При выявлении щелочной фосфатазы гранулы азокрасителя в цитоплазме псевдоэозинофилов имеют красно-малиновый цвет, круглую форму, по размерам и количеству полностью соответствуют вторичным гранулам. Полученные данные свидетельствуют, что в зрелых псевдоэозинофилах кролика пероксидаза и щелочная фосфатаза локализуются во вторичных гранулах. Продукты цитохимической реакции на
кислую фосфатазу в псевдоэозинофилах кролика располагаются диффузно в межгранулярных участках цитоплазмы. Крупных гранул азокрасителя в цитоплазме нет, что свидетельствует об отсутствии первичных гранул в псевдоэозинофилах кролика т. к. кислая фосфатаза является маркером первичных гранул.
В сегментоядерных нейтрофилах морских свинок и белых крыс вторичные гранулы ярко окрашены эозином, но их размеры меньше, чем у кролика. Эти клетки крови морских свинок и белых крыс правомочно называть псевдоэозинофилами, т.к. их вторичные гранулы окрашиваются исключительно эозином в ярко-красный цвет. В цитоплазме псевдоэозинофилов морских свинок и белых крыс отсутствуют первичные гранулы. Цитохимические реакции на миелопероксидазу, катионные белки и щелочную фосфатазу показали, что все исследуемые компоненты локализуются во вторичных гранулах. Цитохимическая реакция на кислую фосфатазу в псевдоэозинофилах морских свинок и белых крыс носит диффузный характер, в цитоплазме нет крупных гранул азокрасителя, близких по размерам первичным гранулам. Это свидетельствует в пользу отсутствия у этих животных первичных гранул.
В псевдоэозинофилах кур вся цитоплазма заполнена вторичными гранулами крупных размеров и необычной формы: вытянутой с заостренными концами. Вторичные гранулы псевдоэозинов кур окрашиваются только эозином. Первичных гранул нет. При цитохимическом выявлении катионных в цитоплазме псевдоэозинофилов обнаруживается большое количество структур зеленого цвета, которые по размерам, форме и количеству полностью соответствуют вторичным гранулам (рис. 4.). Это доказывает локализацию в них катионных белков. Кислая фосфатаза выявляется в межгранулярных участках цитоплазмы в виде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.