МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 501-506
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.217.34
ПЕРВЫЙ НУКЛЕОТИД КОДОНА В Р-УЧАСТКЕ 80S РИБОСОМ СБЛИЖЕН С НУКЛЕОТИДОМ G1702 18S рРНК - ПО ДАННЫМ СШИВОК С ПРОИЗВОДНЫМ pUUUGUU, НЕСУЩИМ ПЕРФТОРФЕНИЛАЗИДОГРУППУ НА ОСТАТКЕ ГУАНИНА
© 2004 г. Н. А. Демешкина, M. Н. Репкова, А. Г. Веньяминова, Д. M. Грайфер, Г. Г. Карпова*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 23.10.2003 г.
В работе изучали модификацию 18S рРНК производным pUUUGUU, несущим перфторфенилази-догруппу на атоме N7 остатка гуанина, в составе комплекса с 80S рибосомами человека и Val-тРНк , которая направляет модифицированный кодон GUU в Р-участок. С помощью метода обратной транскрипции показано, что модификации подвергается инвариантный нуклеотид G1702 18S рРНК. На основании сопоставления полученных результатов с данными по аффинной модификации рибосом человека производными тетра- и гептарибонуклеотидов с алкилирующей группой на З'-конце сделан вывод о том, что между кодонами в А- и Р-участках 80S рибосомы матрица делает изгиб, в результате чего эти кодоны оказываются сближенными с G1702 18S рРНК.
Ключевые слова: 80S рибосома, аффинная модификация, аналог мРНК, А- и Р-участки рибосомы, 18S рРНК.
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в изучении структурно-функциональной организации рибосом бактерий с помощью метода рентгеноструктурного анализа [1-5]. В частности, стало возможным получить представление о компонентах рибосомы, взаимодействующих с мРНК в процессе элонгации на атомном уровне. Эти данные хорошо согласуются с данными более ранних работ по изучению мРНК-связываю-щего центра рибосом прокариот с помощью метода аффинного химического сшивания [6, 7]. На сегодняшний день этот метод остается пока единственным, позволяющим получать детальную информацию о строении функциональных центров рибосом эукариот. С использованием метода аффинного химического сшивания накоплено много данных о расположении матрицы на 80S рибосомах человека. Так, с помощью коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклео-тидов с различными типами сшивающих групп и разными местами присоединения их к олигорибо-нуклеотиду, на уровне отдельных нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков изучено окружение каждого из нуклеотидов кодонов матрицы в А-, Р- и E-участках 80S рибосом [8-11]. Сопоставление данных, полученных на 80S рибосомах человека, с данными рентгеноструктурного анализа
Принятые сокращения: SDS - додецилсульфат натрия; EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота; ПААГ - поли-акриламидный гель.
*Эл. почта: karpova@niboch.nsc.ru
рибосом бактерий позволило впервые выявить универсальные черты расположения мРНК на рибосомах. Так, кодоны мРНК в А-, Р- и Е-участ-ках сближены с нуклеотидами, занимающими одинаковое положение во вторичной структуре рРНК малых субчастиц, а между кодонами в Р- и Е-участках имеется резкий изгиб.
Очевидно, для получения более детальной информации об окружении кодонов мРНК на рибосоме целесообразно использовать набор аналогов мРНК, которые отличались бы природой нуклео-тида, несущего сшивающую группу. Например, установлено, что те нуклеотиды 18S рРНК, которые сшиваются с модифицированными остатками ура-цила и гуанина в положении -3 (относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке), отличаются [12, 13]. То же можно сказать о модифицированных остатках гуанина и урацила в положении +5 или +6 [10]. Так, модификация одного из четырех нуклеотидов 18S рРНК, которые сшиваются с аналогами мРНК, несущими фотоактивируемую группу на остатке гуанина, не происходит, если используются аналоги с перфторфенилазидо-группой на остатке урацила.
В предыдущей работе для определения нуклеотидов 18S рРНК, сближенных с первым нуклео-тидом кодона мРНК в Р-участке (т.е. нуклеотида в положении +1), использовали производные оли-горибонуклеотидов, содержащие перфторфени-лазидогруппу, присоединенную либо к 5'-фосфа-ту, либо к атому С5 остатка урацила [12]. В насто-
ящей работе для определения нуклеотидов 1SS pPHK, соседствующих с нуклеотидом матрицы в положении +1, использовали аналог мPHK - производное pUUUGUU с перфторфенилазидогруп-пой на атоме N7 остатка гуанина.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали Val^PH^^ (1S00 пмоль/OE^) E. coli, любезно предоставленную Т.Г. Шапкиной (СТИЯФ PAH, г. Гатчина). Oли-годезоксирибонуклеотид, комплементарный последовательности 1197-1216 1SS pPHK человека, синтезировали в лаборатории медицинской химии Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИXБФM) CO PAH, а оли-гомеры, комплементарные последовательностям 139S-1417, 1621-1639 и 1S12-1S31 1SS pPHK, любезно предоставлены П. Воллензиеном (Университет штата дверная ^ролина, г. Poли, CШA). [Y-32P]ATP (100 Kи/ммoль) синтезирован в лаборатории биотехнологической химии ИXБФM CO PAH.
Синтез гексарибонуклеотида UUUGUU проводили, как описано ранее [14].
Производное UUUGUU, несущее перфторфе-нилазидогруппу на атоме N7 остатка гуанина, получали по описанной методике [15]. Производное метили по 5'-концу с помощью [y-32P]ÁTP и выделяли, как описано ранее [16].
Выделение 40S и 60S рибосомных субчастиц проводили по методике, описанной ранее [17].
Для получения SOS рибосом субчастицы реактивировали в буфере A, содержащем 20 hM Трис-HCl, pH 7.5, 120 mM KCl, 13 mM MgCl2 и 0.65 mM EDTÁ, при 37°C в течение 10 мин и смешивали в мольном соотношении 40S:60S = 1:1.3. A^rae-ность рибосом в поли^^зависимом связывании [^QPhe^PHK^6 составляет 70% (т.е. 1.4 моль [^C^he^H^^ связывается с 1 моль 80S рибосом).
Koмплeкcы рибосом с аналогом мPHK получали, инкубируя 80S рибосомы (конечная концентрация S x 10-7 M) с 5'- ^-меченным аналогом (4 x x 10-6 M) и Val-тPHKVal (7 x 10-6 M) в буфере A при 23°C в течение 50 мин. Огепень связывания 5'- ^-меченного аналога с 80S рибосомами определяли с помощью фильтрования комплексов через нитроцеллюлозные фильтры (с диаметром пор 0.45 мкм), предварительно обработанные 0.5 M раствором NaOH в течение 30 мин при 25°C; радиоактивность фильтров, помещенных во флаконах, определяли в воде по Черенкову.
Облучение комплексов, анализ модификации рибосомных субчастиц и распределение модификации между pPHK и рибосомными белками проводили, как описано [18].
PHK из облученных комплексов выделяли и анализировали, как описано [19].
Участки 18S рРНК, содержащие нуклеотиды, сшитые с аналогом мРНК, определяли, гидроли-зуя модифицированную рРНК РНКазой H в присутствии олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным последовательностям 18S рРНК. Гидролиз рРНК в составе гетеродуплексов с помощью РНКазы H и анализ продуктов гидролиза методом электрофореза в 5%-ном ПААГ проводили, как описано [20].
Нуклеотиды 18S рРНК, с которыми сшивается аналог мРНК, определяли с помощью обратной транскрипции по описанной методике [21]. Реакционные смеси содержали по 1 пмоль 18S рРНК и 5'-32Р-меченного праймера. По окончании реакции образцы обрабатывали и анализировали, как описано [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Аффинную модификацию 80S рибосом производным pUUUGUU, несущим перфторфенилази-догруппу на атоме N7 остатка гуанина, проводили в составе тройного комплекса, образованного в присутствии тРНК. Контролем для тройного комплекса служил бинарный комплекс, образующийся в отсутствие тРНК. Тройной комплекс получали, инкубируя 80S рибосомы с меченным 32Р аналогом мРНК и Уа1-тРНКУа1, которая направляет модифицированный валиновый кодон GUU в Р-участок [9, 15], к которому тРНК в любой форме в отсутствие факторов трансляции имеет наибольшее сродство [22-24]. Таким образом, в тройном комплексе модифицированный остаток гуанина находится в положении +1. Степень связывания аналога мРНК в тройном комплексе составляет примерно 0.15 моль аналога на моль 80S рибосом, что более чем в 6 раз превышает степень связывания этого аналога с 80S рибосомами в бинарном комплексе.
Для образования сшивок между 32Р-меченным аналогом мРНК и рибосомами, тройной и бинарный комплексы облучали УФ-светом (к > 280), после чего комплексы диссоциировали и рибо-сомные субчастицы разделяли центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы в условиях диссоциации 80S рибосом (4 мМ Mg2 + и 300 мМ KCl) (соответствующие профили элюции не приведены). Анализ показал, что в тройном комплексе около 45% аналога мРНК, связавшегося с рибосомами, сшивается с 40S субчастицами, в то время как степень модификации 40S субчастиц в бинарном комплексе незначительна. В обоих комплексах сшивок аналога мРНК с 60S субчастицами практически не происходит. Последующий анализ 40S субчастиц, модифицированных в тройном комплексе, с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы в присутствии SDS и EDTA (соответствующий профиль элюции не приведен), показал, что во фракции 18S рРНК содержится около 30% радиоактивной метки от общего количества метки, включившей-
первый нуклеотид кодона
503
6 7 9 1
1 1 3 3
2 6 8
1 1 1 1
1 7 1 8 1 21 1 2
9 9 1
1 3 6 8
1 1
18S
тРНК
18S( 1869)
1811 1620
229
тРНК 38
Рис. 1. Анализ сшивки производного pUUUGUU с РНК в составе комплексов с 80S рибосомами с помощью электрофореза в 5%-ном (а и б) и 8%-ном (в) ПААГ в денатурирующих условиях (радиоавтографы). а - Анализ сшивки с 18S рРНК и тРНК. Дорожки 1 и 2 - тройной и бинарный комплексы, соответственно. б - Анализ продуктов гидролиза 18S рРНК РНКазой Н в присутствии набора олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным последовательностям 18S рРНК (указаны сверху). Дорожки пронумерованы снизу. Дорожка К - 18S рРНК, сшитая с производным pUUUGUU в тройном комплексе и обработанная РНКазой Н в отсутствие олигодезоксирибонуклеотида. Стрелками указаны положения фрагментов, наблюдаемых в окрашенном геле; указаны приблизительные длины этих фрагментов (без учета длины пришитого олигорибонуклеотида и участков 18S рРНК, которым комплементарны использованные олигодезоксирибонуклеотиды). в - Анализ продуктов обратной транскрипции модифицированной 18S рРНК, полученных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.