научная статья по теме PH МОЖЕТ ИГРАТЬ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ PAH ДОМЕНОВ ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ ИХ СТРУКТУРЫ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ Химия

Текст научной статьи на тему «PH МОЖЕТ ИГРАТЬ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ PAH ДОМЕНОВ ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ ИХ СТРУКТУРЫ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 497 - 507

УДК 577.214

pH МОЖЕТ ИГРАТЬ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ PAH ДОМЕНОВ ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ Ж СТРУКТУРЫ И ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ*

© 2015 Таухеед Хасан1#, Машук Али1#, Даман Салуя1, Лаишрам Раджендракумар Сингх1**

University of Delhi, Dr. B. R. Ambedkar Center for Biomedical Research, India, Delhi-110-007; fax: +91(11)276-66248, E-mail: directoracbr@gmail.com, director@acbr.du.ac.in

Поступила в редакцию 19.08.14 После доработки 29.09.14

Регулятор транскрипции Sin3B в клетках человека (hSin3B) представляет собой адапторный белок (scaffold protein), который взаимодействует с различными транскрипционными факторами и регулирует транскрипцию. Он состоит из шести консервативных доменов: домена, взаимодействующего с деацетилазой гистонов (HID), высококонсервативного участка (HCR) и четырех парных амфифильных спиралей (PAH 1-4).Инте-ресно, что PAH домены белка hSin3B в значительной мере гомологичны друг другу, однако каждый из них взаимодействует со строго специфичным набором транскрипционных факторов. Несмотря на то, что различные факторы, взаимодействующие с PAH доменами белка hSin3B, были охарактеризованы, информации о структуре отдельных PAH доменов hSin3B в литературе нет. В настоящей работе мы охарактеризовали структуру и стабильность различных PAH доменов белка hSin3B при физиологических значениях pH, а также при значениях pH, характерных для ядра. Мы показали, что структура нативного состояния и стабильность различных PAH доменов различается при значениях pH, характерных для ядра, при которых hSin3B выполняет свою биологическую функцию. Мы также показали, что структура нативного состояния и термодинамическая стабильность доменов PAH2 и PAH3 при значениях pH, характерных для ядра, отличается от таковых при физиологических значениях pH, тогда как структура домена PAH1 остается неизменной при обоих значениях pH. Полученные результаты свидетельствуют о том, что структурная гетерогенность PAH доменов может обусловливать уникальность набора связываемых транскрипционных факторов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: структура белка, термодинамическая стабильность, круговой дихроизм, регулятор транскрипции, адапторный белок.

8т3 (общий регулятор транскрипции) участвует в регуляции различных биологических процессов, таких как изменение положения нукле-осом (ремоделинг), метилирование ДНК, клеточная пролиферация и апоптоз [1, 2]. 8т3 не связывается с ДНК, но будучи адапторным белком, способствует транскрипции различных генов за счет взаимодействия с транскрипционными факторами с образованием 8т3 комплекса. У человека основной 8т3 комплекс состоит из восьми компонентов: 8Ш3, ИБАС1, ИБАС2, ЯЪАр46, ЯЪАр48, 8АР30, 8АР18 и 8Б83 [3, 4]. 8т3 содержит шесть отдельных консервативных

доменов: HID, HCR и PAH (1-4) [1]. Домены PAH1 и PAH2 в значительной степени схожи у разных организмов, тогда как последовательность PAH3 довольно сильно отличается от последовательностей PAH1 и PAH2 (степень идентичности 25 и 16% соответственно). Тем не менее эти PAH домены узнают различные мотивы, т.е. обладают высокой степенью специфичности по отношению к мишеням [5, 6]. В клетках человека обнаружены две изоформы Sin3 (hSin3A и hSin3B), кодируемые двумя отдельными генами, которые являются, скорее всего, результатом дупликации [7]. Белки Sin3A и Sin3B чело-

Принятые сокращения: HID (histone deacetylase interaction domain) — домен, взаимодействующий с деацетилазой гистонов; HCR (highly conserved region) — высококонсервативный участок; PAH (1—4)(paired amphipathic helires) — четыре парных амфифильных спиралей).

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-235, 15.02.2015.

** Адресат для корреспонденции. # Авторы внесли равный вклад в работу.

века ~57% идентичны друг другу, причем наиболее гомологичные участки приходятся на PAH домены и HID участок [8—9].

Известно, что PAH домены hSin3B отвечают за взаимодействие с различными транскрипционными факторами [10—12]. В клетках человека были идентифицированы различные партнеры, взаимодействующие с доменами PAH1, PAH2 и PAH3 и обеспечивающие выполнение различных биологических функций [13]. B литературе также встречается некоторая информация o структурных и функциональных аспектах PAH доменов [2, 14]. Кроме того, в последнее время появились данные о структуре Sin3 на атомарном уровне, однако большая часть структурных исследований была проведена на РАН доменах белка мышей, а не человека [6, 14—17]. Схватка структурной информации о различных PAH доменах белка из клеток человека затрудняла систематический анализ данных о взаимодействии факторов. В настоящей работе с помощью различных спектроскопических методов мы исследовали различия структуры и стабильности разных PAH доменов Sin3B белка из клеток человека при значениях pH, характерных для ядра (6,3—6,8), и при физиологических значениях pH (7,0). Мы зафиксировали небольшие изменения структуры PAH доменов hSin3B при значениях pH, характерных для ядра, при которых Sin3 выполняет свои биологические функции. Мы также показали, что структура нативного состояния и стабильность PAH2 и PAH3 различаются при значениях pH, характерных для ядра, и при физиологических значениях pH, тогда как структура PAH1 остается неизменной при обоих значениях pH. Полученные нами результаты позволяют предположить, что различия конформации нативной структуры или подвижности структуры PAH доменов может обусловливать специфичность взаимодействия с другими белками.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клонирование, экспрессия и очистка белков.

Библиотеку кДНК из мозга эмбрионов человека амплифицировали согласно рекомендациям производителя («Clontech Laboratory Inc.», США) и использовали для ПЦР-амплификации различных PAH доменов белка hSin3B. Для амплификации использовали праймеры:

5'-AGCTGCGGATCCACGTAGAAGACG-3' и

5'-TCTAGTCTCGAGCCGAGGGGAAGAAAAG-3' (PAH1),

5'-CATAGGGGATCCTGGAGTCCGATTC-3' и

5'-GTGCATCTCGAGCGGCCCGTTTCCTGT-3'

(PAH2)

и

5'-CAGTGGGGATCCACGGGACTCTGCAG-3' и

5'-ATGGAACTCGAGAAGGACAGCTCTTTTACC-3' (PAH3).

При этом прямые праймеры содержали сайт рестрикции BamHl, а обратные праймеры — сайт рестрикции Xhol. Продукты амплификации сначала клонировали в TA вектор («Promega», США), а затем в экспрессирующий вектор pGEX-5 х 3 по сайтам BamHl/Xhol. Полученными плазми-дами трансформировали клетки E. coli DH5alpha, после чего клетки растили в течение ночи на чашках с LB-агаром, содержащим 100 щг/мл ампициллина. Точность клонирования фрагментов анализировали с помощью секвенирования. PAH домены экспрессировали в клетках BL21 (DE3). Клетки E. coli трансформировали полученными плазмидами, отдельные колонии растили в течение ночи в LB, содержащей 100 щг/мл ампициллина при 37° перемешивая со скоростью 250—300 rpm [18]. 1 л свежей среды ино-кулировали 10 мл ночной культуры и растили при интенсивном перемешивании при 250 rpm в течение 3—4 ч до OD 600 равной 0,5—0,6. Суперэкспрессию PAH доменов индуцировали 0,5 мМ изопропил^-1-тиогалактопиранозидом (IPTG) при 37° при интенсивном перемешивании в течение 4 ч, после чего клетки собирали центрифугированием при 8000 g 20 мин при 4°. Осадок клеток замораживали, хранили при —80° и использовали в течение 1 недели.

Клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Tris, pH 8,0 («MP Biomedicals», США), 250 мМ NaCl («G-Biosciences», США), 0,1%-ный NP-40 («Sigma», США) и 1%-ный коктейль ингибиторов бактериальных протеаз («Sigma», США). Клетки лизировали ульразвуком (6 циклов с эффективностью 60%). Для удаления неразрушенных остатков лизат центрифугировали при 8000 g при 4°. Супернатант (4 мл) смешивали с 2 мл (объем слоя) носителя, сопряженного глютатионом («GE Healthcare», США), и инкубировали 30 мин при 4° при покачивании. Носитель промывали пять раз 10 мл фосфатного буфера (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4). Для удаления GST-тэга ~4 мг очищенного рекомбинантного белка инкубировали с 40 щл (1 щг/щл) фермента Factor Xa («GE Healthcare», Великобритания) при 22° 16 ч в 4 мл буфера для расщепления (50 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2). Суспензию центри-

фугировали при 500 g 5 мин с тем, чтобы осадить носитель, и отбирали супернатант, содержащий очищенный белок и Factor Xa. Последний удаляли с помощью колонки ffiTrap Benzamidine FF (high sub) («GE Healthcare», Великобритания). Factor Xa остается на колонке, позволяя собрать чистый свободный от протеаз препарат белка в элюате. Раствор белка диализовали против 0,1 М KCl, pH 7,0, при 4° для удаления соли, после чего препарат лиофилизировали и использовали для дальнейших экспериментов.

Анализ тепловой денатурации проводили с использованием спектрополяриметра Jasco J-810 с пельтье-приставкой при скорости нагревания 1° в мин. Такая скорость обеспечивает достаточное время для достижения равновесия. Каждый образец нагревали от 20 до 85°, регистрируя изменения поглощения при 268 нм. Для построения каждой кривой теплового перехода регистрировали порядка 500 точек. Измерения повторяли, как минимум, трижды. Для анализа обратимости денатурации препарат белка немедленно охлаждали после нагревания. Анализ кривых перехода позволил вычислить Tm (среднюю точку кривой денатурации) и AHm (изменение энтальпии при Tm) с помощью нелинейного метода наименьших квадратов согласно уравнению:

где у(Т) — оптическое свойство при температуре Т (Кельвин), ум (Т) и у0 (Т) — оптические свойства нативных и денатурированных молекул белка при Т (К) соответственно, а Я — газовая постоянная. При анализе кривой перехода было принято допущение, что зависимость оптических свойств нативных и денатурированных молекул белка описывает параболическая функция (т.е. ум (Т) = аN + Ъ^Т + е^Т2 и у0 (Т) = а0 + + Ъ0Т + е0Т2, где а-ы, Ъш еш а0, Ъ0 и е0 — коэффициенты, не зависящие от температуры). Графики зависимости АНт от Тт при разных значениях рН позволили вычислить значение удельного теплопоглощения АСр при постоянном давлении. Изменения свободной энергии Гиб-бса при температуре Т — (Т) оценивали с помощью уравнения Гиббса—Гельмгольца (

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»