МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 43-49
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.2
ПИГМЕНТАЦИЯ SERRATIA MARCESCENS И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПРОДИГИОЗИНА
© 2015 г. И. Н. Андреева1, Т. И. Огородникова
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦРАН Поступила в редакцию 06.03.2014 г.
Пигментация Serratia marcescens зависит от состава ростовой среды. На глицерин-пептонной среде культура окрашена в красный цвет, на среде с ацетатом — в желтый (желто-оранжевый), окраска культуры определяется рН среды. В клетках культуры S. marcescens, растущей на глицерин-пептонной среде и имеющей визуально красный цвет, присутствуют две спектральные формы продигиозина: "красная" с максимумом поглощения 535 нм и "желтая" (460—470 нм). Спектр поглощения продигиозина в составе нативного пигмент-белкового комплекса отличается от спектра пигмента, растворенного в этаноле, и сходен с абсорбционным профилем клеточной суспензии наличием в нем дополнительного максимума поглощения при 500 нм. Чувствительность продигиозина к низкоинтенсивному свету видимого диапазона зависит от состояния совместно солюбилизированного с ним белка. Светочувствительность продигиозина в комплексе с нативным белком близка к светочувствительности пигмента в составе целостной бактериальной клетки. Продигиозин, выделенный в денатурирующих условиях, менее чувствителен к освещению. Как "красная", так и "желтая" формы продигиозина в растворе флуоресцируют в области 560—565 нм; in vivo более выражена флуоресценция "красной" формы пигмента.
Ключевые слова: Serratia marcesens, пигментация культуры, продигиозин, спектр поглощения, флуоресценция.
DOI: 10.7868/S0026365615010024
Способность образовывать пигмент продигиозин относится к видовым характеристикам Serratia marcescens [1—3]. Обусловленная проди-гиозином окраска S. marcescens обычно описывается в литературе как красная различных оттенков, тогда как в растворе продигиозин может находиться в двух формах (в зависимости от растворителя и рН): с максимумом поглощения 535 нм и 460—470 нм [4—7], имеющих, соответственно, красную и желтую (желто-оранжевую) окраску. Несмотря на длительную историю изучения пигментообра-зования S. marcescens, роль продигиозина до сих пор неясна. Высказывались предположения о фотопротекторном действии этого пигмента [6], участии его в дыхании [5]. Существует также мнение, что биосинтез продигиозина обеспечивает клетке лишь сброс избытка восстановительных эквивалентов и энергии [8, 9]. Чаще всего отмечаются антибиотические свойства продигиозина [2, 10—15].
По структуре продигиозин (линейный три-пиррол) относится к тому же классу, что и такие биологически важные соединения как гем, хло-рофиллы, фикобилины [16, 17]. Это делает небезосновательным предположения об участии продигиозина в энергетическом метаболизме клетки.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: Andreyeva@mail.knc.ru).
Интенсивная окраска указывает на потенциальное значение видимого света для S. marcescens. Ранее нами, методом фотомикрокалориметрии, была показана возможность запасания световой энергии пигментированной культурой S. marcescens [18], что вызывает закономерный интерес к изучению спектральных свойств продигиозина и фотореакций, происходящих с пигментом под действием видимого света. S. marcescens — классический гетеротрофный организм, и количественно выявленный эффект, по сравнению с фото-синтезирующими организмами, невелик (около одного процента от энергозапасания культурой микроводоросли Chlorella vulgaris) [18].
Исходя из этого, представляется рациональным изучение физиологической роли продигиозина начать с выявления фотореакций, происходящих с его участием in vitro. Имеющиеся в литературе сведения о свойствах продигиозина (в том числе и спектральных) относятся к чистому пигменту. Однако включение продигиозина в метаболические процессы возможно только через взаимодействие с клеточными белками. Спектральные свойства свободного пигмента и пигмента, связанного с белком, могут различаться [16]. Это предполагает выделение и изучение продигиозина в комплексе с нативным белком, сохраняющим, по-возмож-
ности, основные характеристики пигмента близкими к таковым in situ.
В представленной работе проведено сравнение спектральных свойств продигиозина в растворе и в составе пигмент-белкового комплекса, выделенного из S. marcescens, и сопоставление их со спектральной характеристикой бактериальной культуры с целью выявления возможности использовать пигмент-белковый комплекс для изучения функции продигиозина в метаболизме клетки-продуцента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы пигментированные штаммы S. marcescens АТСС 9986 и 33, полученные из коллекции культур кафедры микробиологии Казанского университета. Культивирование осуществляли в глицерин-пептонной среде (пептон — 10 г/л, глицерин — 5 г/л, рН 7—7.2) и минеральной среде М9, а также использовали мо-дифицрованные питательные среды на их основе; изменение состава касалось замены источника углерода: среды содержали либо глицерин — 5 г/л, либо ацетат — 10 г/л, либо глюкозу — 5 г/л. Посевным материалом служили клетки культуры, выращенной на агаризованной среде и ресуспендиро-ванной в физиологическом растворе. Культуру выращивали в колбах объемом 250 мл с 50 мл среды, при постоянном перемешивании 200 об./мин, при температуре 28°C.
При изучении влияния освещения использовали белый свет от флуоресцентной лампы (white, "Hitachi") интенсивностью светового потока 22.8 мкМ фотонов/м2 с; для выделения тех областей спектра, в которых происходит поглощение продигиозина, использовали светофильтры ЗС-10 (500-600 нм) и СС-5 (340-470 нм)
Рост бактериальной культуры оценивали по оптической плотности (Е670) спектрофотомет-рически. Для количественного определения про-дигиозин экстрагировали подкисленным соляной кислотой этанолом в соотношении 1 : 9, концентрацию продигиозина рассчитывали по поглощению при 535 нм, используя коэффициент экстинкции 51.5 х 103 л/г см [19].
Пигмент-белковый комплекс получали, обрабатывая биомассу 0.1% раствором додецил-суль-фата натрия или Тритона Х-100 с последующим центрифугированием для освобождения от остатков биомассы. Пигмент-белковый комплекс очищали высаливанием сульфатом аммония (0.2 от насыщающей концентрации), собранный флотирующий осадок диализовали и ресуспендировали в воде или 0.1% растворе детергента. Приготовленный таким образом препарат содержит очищенный пигмент-белковый комплекс, дающий
на электрофореграмме в ПААГ единственную полосу [20].
Контролем для оценки светочувствительности продигиозина в составе пигмент-белкового комплекса служила суспензия нерастущих клеток в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7.0).
Абсорбционные спектры регистрировали на спектрофотометре Lambda-25 ("Perkin Elmer"). Спектры флуоресценции — на флуориметре Флуорат-02 Панорама ("Люмэкс").
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пигментированные культуры S. marcescens АТСС 9986 и 33 растут в пептонных средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глицерин, глюкозу или ацетат. Наибольшее накопление биомассы (10—12 г/л) и максимальное пигментообразование (0.3—0.4 мг/л) происходит в среде с глицерином, несколько меньше накапливается продигиозина в среде с ацетатом (0.08— 0.15 мг/л). Питательная среда, содержащая в качестве источника углерода и энергии глюкозу, не обеспечивает условий для синтеза продигиозина. Культивирование на глицерин- и ацетат-пептоне сопровождается защелачиванием ростовой среды (на 6—7 сут: до рН 7.8—8.5 на глицерине и до 9—9.5 на ацетате), тогда как на глюкозе наблюдается сильное закисление (до рН 4—4.5, иногда — до 3.5).
Пигментообразование изучаемых культур S. marcescens зависит также и от источника азота. Обе культуры хорошо растут как в средах с органическим (пептон), так и с минеральным (нитрат) источником азота, однако, пигмент накапливают только в средах с пептоном. Добавление к минеральной среде пролина (до 3—5 мг/мл) — предшественника биосинтеза продигиозина [21], не стимулирует пигментообразование.
При росте на глицерин-пептонной среде (как жидкой, так и агаризованной) обе культуры S. marcescens окрашены в красный цвет различных оттенков (молодые культуры — ярко-красные, с возрастом приобретают вишневый оттенок). Культура 9986 на агаризованной среде имеет ярко выраженный "металлический" блеск, который у культуры 33 либо выражен слабо, либо отсутствует. При росте на среде с ацетатом культуры приобретают желтый (желто-оранжевый) цвет. В литературе описана желтая пигментация у S. marcescens, обусловленная продигиозином [5]. Кроме того, желтую окраску бактерий этого вида может вызывать образование производных муко-новой кислоты [22], а также каротина [23]. Экстракция пигмента из биомассы изучаемых нами штаммов, выращенных на ацетат-пептонной среде, в стандартных условиях (подкисленным этанолом) дает раствор красного цвета со спектром, характерным для "красной" формы продигиозина
350 400 450 500 550 Длина волны, нм
600 650
400 450 500
Длина волны, нм
550
600
Рис. 1. Влияние рН на спектр поглощения спиртового раствора продигиозина: 1 — рН 4; 2 — рН 10; 3 — рН 7.5.
Рис. 2. Влияние состава ростовой среды на абсорбцию S. marcescens в видимом диапазоне: 1, 2 — шт. 9986; 3, 4 — шт. 33. 1, 3 — в глицерин-пептонной среде; 2, 4 — в ацетат-пептонной среде.
1
(максимум поглощения 535 нм). При экстракции нейтральным этанолом раствор окрашивается в желтый цвет и имеет максимум поглощения 460— 470 нм, подкисление вызывает смещение максимума поглощения в область 535 нм и соответствующее изменение окраски раствора. Подобное изменение окраски в зависимости от рН раствора характерно для продигиозина [4, 7]. Таким образом, пигментация изучаемых нами культур Б. тагевзевт, растущих в среде с ацетатом, определяется "желтой" формой продигиозина. В целом, как окраска растущей культуры Б. тагевзевт, так и суспензии нерастущих клеток зависит от рН среды.
Окраска раствора продигиозина определяется соотношением "красной" (максимум поглощения 535 нм) и "желтой" (460—470 нм) форм пигмента, что, в свою очередь, зависит от конечной рН раствора. Нейтральный и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.