УДК 577.2
piРНК КЛАСТЕРЫ КАК ОСНОВНОЙ ИСТОЧНИК КОРОТКИХ РНК В ТЕРМИНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ
Обзор
© 2013 г. И.А. Оловников, А.И. Калмыкова*
Институт молекулярной генетики РАН, 123182 Москва, пл. Академика Курчатова, 2; факс: +7(499)196-0221, электронная почта: allakalm@img.ras.ru
Поступила в редакцию 04.02.13
Белки Piwi, относящиеся к семейству белков Agonaute, и связанные с ними короткие РНК (Piwi interacting RNA, piPHK) контролируют перемещения мобильных элементов (МЭ) в терминальных тканях животных. piPHK производятся особыми участками генома, называемыми piPHK кластерами. В большинстве случаев piPHK кластеры представляют собой протяженные локусы, обогащенные фрагментами разрушенных копий МЭ. Попадание нового МЭ в кластер приводит к образованию гомологичных ему piPHK и инактивации МЭ этого типа. Считается, что piPHK образуются из длинных транскриптов-предшественников, кодируемых кластерами. Эти участки обладают особой структурой хроматина, которая, возможно, важна для их распознавания как источника piPHK. В обзоре на примере Drosophila и других организмов представлены новые данные о структурной организации piPHK кластеров и биогенезе piPHK, которые важны для понимания ключевого эпигенетического механизма, обеспечивающего защиту генома от экспансии МЭ.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: piPHK, Piwi, мобильные элементы, герминальные ткани, хроматин, Drosophila.
Короткие РНК, ассоциированные с белками семейства Agonaute (Ago), играют важную роль в регуляции экспрессии генов на всех стадиях развития в большинстве изученных эукариот. Анализ коротких РНК из терминальных тканей животных, помимо уже известных siPHK (small interfering RNA) и miPHK (micro RNA), обнаружил отдельный класс коротких РНК, которые получили название piPHK (Piwi interacting RNA) [1, 2]. Как видно из их названия, биология piPHK неразрывно связана с белками подсемейства Piwi из семейства Ago. Главной функцией piPHK является защита генома от активности мобильных элементов (МЭ), повышенная экспрессия которых в клетках-предшественниках половых клеток (герминальных клетках) может привести к высокой частоте транспозиций и передаче потомству вредных инсерционных мутаций. piPHK позволяют распознавать мРНК МЭ и вызывать их разрушение за счет эндонуклео-литической активности белков Piwi.
Биогенез piPHK отличается от биогенеза siPHK и т1РНК рядом особенностей. piPHK имеют большую длину (в случае дрозофилы, 24—28 нт в отличие от 21 нт для siPHK и 22 нт для miPHK)
* Адресат для корреспонденции.
и предпочтения определенных нуклеотидов в некоторых позициях. Так же, как и для siPH^ для piPHK характерно 2'-0-метилирование [3—8]. Продукция piPHK не зависит от РНК эндонукле-аз III типа (Dicer), разрезающих двунитевые РНК и необходимых для созревания siPHK и miPHK [3, 9]. Это и ряд других данных указывают на то, что piPHK образуются из однонитевых предшественников. Механизм вырезания piPHK из длинного транскрипта-предшественника, который называют первичным процессингом piPHK, до сих пор остается загадкой. Для большинства первичных piPHK характерно наличие уридина в первом положении (1U) [6, 10, 11]. Наконец, сек-венирование и картирование piPHK на геном показывает, что большая часть piPHK происходит из дискретных локусов, лишенных генов, но обогащенных фрагментами разрушенных МЭ [6]. Эти локусы, называемые piPHK кластерами, многочисленны (к примеру, ~150 кластеров у дрозофилы) и могут быть очень протяженными (более 200 т.п.н.) [6]. В случае дрозофилы piPHK кластеры расположены, как правило, в перицентромерных или субтеломерных областях хромосом и суммарно составляют ~3,5% генома.
Как и многие другие Ago, белки подсемейства Piwi обладают так называемой «слайсер-
747
2*
ной» активностью, т.е. способностью разрезать мРНК, комплементарные коротким РНК [4, 5]. Этот процесс называют посттранскрипционным сайленсингом (PTGS, posttranscriptional gene silencing). Для piPHK-зависимого PTGS необходима компартментализация: так, в терминальных клетках большинство известных факторов piPHK пути расположены в перинуклеар-ных гранулах, образующих особую структуру — «нюаж» (от франц. nuage, облако) [12, 13]. Однако у многих организмов существует также внутриядерная функция Ago белков, где они вызывают транскрипционный сайленсинг последовательностей, комплементарных коротким РНК (TGS, transcriptional gene silencing). Впервые TGS был описан для дрожжей и растений [14, 15], но сегодня его роль в РНК сайленсинге уже твердо установлена и для животных. У млекопитающих piPHK вызывают метилирование про-моторных участков гомологичных локусов, что приводит с транскрипционному сайленсингу ретротранспозонов [16]. Для дрозофилы показано, что в отсутствие piPHK увеличивается транскрипционная активность РНК-полимеразы на последовательностях различных МЭ [17]. Применение полногеномных методов исследования показало, что нарушение piPHK-зависимого TGS приводит к увеличению количества РНК-полимеразы II на промоторах МЭ и, как следствие, к активации их транскрипции в соматических клетках яичника Drosophila [18].
piPHK кластеры являются центральным звеном piPHK пути, так как их транскрипты дают начало коротким PHK, участвующим в двух важнейших процессах — транскрипционной и посттранскрипционной репрессии присутствующих в геноме МЭ. ^оме того, piPHK кластеры обеспечивают адаптивность piPHK-ответа при инвазиях новых МЭ, ибо интеграция МЭ в эти локусы провоцирует синтез новых piPHK. В данном обзоре мы обсуждаем накопленные данные по биологии piPHK кластеров, в первую очередь, на примере Drosophila.
ПРОИСХОЖДЕНИЕ piРНК В ТЕРМИНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ В^орЫПа
Наиболее полно роль р1РНК изучена в яичниках Drosophila. Яичник дрозофилы состоит из овариол, каждая из которых является рядом яйцевых камер на последовательных стадиях развития (рис. 1). Яйцевая камера содержит терминальные клетки (ооцит и 15 питающих клеток, объединенных каналами) и соматические фолликулярные клетки, окружающие ооцит. К моменту откладки яйца фолликулярные и питаю-
щие клетки отмирают. На апикальном конце каждой овариолы расположен гермарий, в котором находятся соматические и терминальные стволовые клетки, потомки которых образуют яйцевые камеры и ооцит. Главная ветвь piPHK пути работает в герминальных клетках яичника, так как в них экспрессируются все три белка подсемейства Piwi — ядерный белок Piwi и ци-топлазматические факторы — Aubergine (Aub) и Ago3. В фолликулярных клетках экспрессируется только один из трех белков подсемейства Piwi — собственно Piwi. Изучение популяций piPHK в яичниках мутантов Aub и Ago3 позволило разделить МЭ на три класса: регулируемые в герми-нальных клетках, в соматических клетках и смешанные. Эта классификация указывает на то, где происходит экспрессия МЭ и подавление их активности с помощью piPHK. Ниже будут рассмотрены структурно-функциональные особенности piPHK кластеров в фолликулярных и гер-минальных клетках яичников, а также в семенниках Drosophila melanogaster.
piPHK кластеры фолликулярных клеток Drosophila. Простейшей моделью для исследования piPHK пути являются фолликулярные клетки дрозофилы. Здесь не экспрессируются многие факторы герминального piPHK пути, необходимые для амплификации piPHK (см. ниже), комплементарных транспозонам [11, 19]. Также нет околоядерной структуры nuage, характерной для герминальных клеток и содержащей множество компонентов piPHK пути. В фолликулярных клетках происходит лишь т.н. первичный процессинг piPHK, который состоит в разрезании транскриптов, кодируемых piPHK кластерами, их связывании с белком Piwi и последующим укорочением З'-конца (3'-5'-экзонуклеоли-тический «тримминг» и 2'-О-метилирование) [11, 20]. Сравнение популяций piPHK из целых яичников и отложенных яиц, в которых отсутствуют фолликулярные клетки, показало, что в фолликулярных клетках piPHK происходят в основном из перицентромерного локуса на X-хро-мосоме, ранее известного как flamenco и необходимого для контроля активности ретровирус-подобных ретротранспозонов gypsy, ZAM, Idefix, экспрессирующихся в фолликулярных клетках и способных инфицировать герминальные клетки [11, 21—23]. Это наблюдение было подтверждено секвенированием piPHK из яичников с нарушенным герминальным piPHK путем [10], а также из культуры соматических клеток яичника дрозофилы (ovarian somatic cells, OSC) [19, 24]. Подавляющее число уникальных piPHK из локуса flamenco картируются только на одну из цепей локуса, что предполагает их образование из длинного одноцепочечного транскрипта (рис. 1).
Важно, что фрагменты МЭ в этом локусе находятся в противоположной ориентации относительно цепи, продуцирующей р1РНК [6]. Таким образом, достигается обогащение популяции теми р1РНК, которые комплементарны мРНК активных транспозонов и, следовательно, могут их эффективно супрессировать [25].
Ранее было показано, что интеграция трансгенов в дистальную область flamenco нарушает работу локуса и активирует ретротранспозон gypsy, что указывало на присутствие дискретного промотора, который инициирует транскрипцию предшественника [26]. Действительно, в таких мутантах количество piPHK из flamenco
Рис. 1. piPHK кластеры в яичнике Drosophila melanogaster. В верхней части рисунка дано схематическое изображение яичника дрозофилы; слева — общий вид; справа — строение овариолы. Указаны терминальные и фолликулярные клетки. Пунктирными стрелками вынесены схемы организации piPHK кластеров в терминальных (сверху) и соматических (снизу) клетках [6]. На каждой схеме дан общий план хромосомы, где по вертикали обозначена плотность piPHK, имеющих уникальные места картирования в геноме. piPHK кластеры расположены преимущественно в перицентромерных районах хромосом. Пунктирной линией вынесены увеличенные фрагменты крупных перицентромерных piPHK кластеров (для терминальных клеток это крупнейший кластер, расположенный в локусе 42АВ на хромосоме 2; для соматических клеток — расположенный в локусе 20A на Х-хромосоме, известный как flamenco), где стрелками обозначены ориентации фрагментов МЭ, а по вертикали показана плотность piRNA на геномных + (сверху) и — (снизу) цепях. piPHK проис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.