ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 1, с. 13-21
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.164
ПЛЕЙОТРОПНЫЙ ЭФФЕКТ МУТАЦИИ fas5 НА РАЗВИТИЕ ПОБЕГА
ARABIDOPSIS THALIANA © 2015 г. А. В. Альберт*, У. Н. Кавай-оол**, Т. А. Ежова*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992, Москва, ул. Ленинские Горы, ГСП1 **Тувинский государственный университет 667000, Кызыл, ул. Ленина, 36 E-mail: eugenealbert2010@gmail.com Поступила в редакцию 16.07.2014 г. Окончательный вариант получен 27.08.2014 г.
В работе охарактеризована новая мутация, вызывающая развитие многочисленных меристематиче-ских очагов в составе апикальной меристемы побега, которые могут давать начало новым стеблевым осям или приводить к фасциации стебля. Мутация wus-1 эпистатирует развитие дополнительных апикальных меристем у мутантаfas5, что указывает на последовательное действие генов при формировании апикальной меристемы побега и участие гена FAS5 в ограничении области экспрессии гена WUS. Эту функцию ген FAS5 выполняет независимо от других негативных регуляторов гена WUS — генов CLV, о чем свидетельствует аддитивный фенотип двойных мутантов fas5 clv2-1 и fas5 clv3-2. Помимо влияния на развитие апикальной меристемы побега мутация fas5 вызывает изменение формы и числа листьев, ускоряет переход растений на репродуктивную стадию развития и приводит к развитию новообразований на стебле (почек, рыльцевой ткани и семяпочек). Мутация вызывает также изменения морфологии клеток апикальных меристем и листа, указывающие на активацию в клетках эндоредупликации ДНК. Плейотропный эффект мутации fas5 на разные стадии онтогенеза и разные органы свидетельствуют о том, что ген FAS5 играет сложную регуляторную роль на всех стадиях развития побега A.thaliana, и его мишенями (прямыми или непрямыми) являются многие гены.
Ключевые слова: генетический контроль развития побега, Arabidopsis thaliana, апикальная меристема, мутанты, генные взаимодействия.
DOI: 10.7868/S0475145015010036
ВВЕДЕНИЕ
Развитие растения обеспечивается за счет постоянного поддержания пула стволовых клеток (СК) апикальной меристемы побега (АМП) и корня. АМП растений состоит из пула медленно делящихся СК, расположенных в центральной зоне, и быстро делящихся дифференцирующихся клеток в периферической зоне, из которых в дальнейшем образуются различные типы тканей и формируются примордии боковых органов побега. Важным компонентом АМП служит организующий центр, расположенный под центральной зоной и являющийся нишей СК меристемы (Stahl, Simon, 2010; Barton, 2010).
У Arabidosis thaliana (L.) Heynh. ключевая роль в поддержании постоянства пула СК АМП принадлежит системе генов WUS-CLV3, действую -щих по принципу отрицательной обратной связи (Brand et al., 2000). Ген WUS экспрессируется в организующем центре, его продукт — транскрипционный фактор WOX-семейства (Haecker et al.,
2004) поступает в вышележащие СК и регулирует транскрипцию многих генов (Busch et al., 2010; Yadav et al., 2011; Yadav et al., 2013). Это обеспечивает поддержание СК в недифференцированном состоянии и стимулирует их пролиферативную активность. Белок WUS индуцирует в клетках центральной зоны экспрессию гена CLV3, кодирующего небольшой секреторный белок, который, активируя рецепторные молекулы CLV1, CLV2, CRN, RPK2/TOAD2 (Ogawa et al., 2008; Muller et al., 2008; Kinoshita et al., 2010), супресси-рует транскрипцию WUS и таким образом предотвращает чрезмерную пролиферацию СК.
На экспрессию WUS влияют и другие гены, оказывающие как индуцирующее, так и супрес-сирующее действие (Williams and Fletcher, 2005; Shen and Xu, 2009; Альберт, Ежова, 2013). Мутации в генах, индуцирующих экспрессию WUS, а также в самом гене WUS приводят к нарушениям функционирования АМ — в первую очередь к преждевременному истощению пула СК и оста-
новке роста, нарушениям формирования органов (Kwon et al., 2005; Ung et al., 2011). Мутации в генах, негативно регулирующих WUS, вызывают увеличение размеров АМП и усиление ее активности, развитие фасциации стебля, нарушение филлотаксиса и увеличение числа органов побега (Clark et al., 1997; Kaya et al., 2001; Han et al., 2008).
К негативным регуляторам WUS входят гены, кодирующие различные по структуре и выполняемой функции белки. Тем не менее, действие большинства негативных регуляторов WUS заключается в ограничении области его экспрессии в пределах организующего центра (Williams and Fletcher, 2005), что обеспечивает закладку и формирование нормальной АМП растения. В данной статье представлены результаты изучения рецессивной мутации fasciata5 (fas5) A. thaliana, характеризующейся увеличением размеров АМП, развитием фасциации и рядом других нарушений. Задачей данной работы являлся детальный анализ влияния мутации fas5 на развитие растений A. thaliana. Для выяснения взаимодействия нового гена с генами WUS и CLV изучали также влияние мутации fas5 на проявление мутаций wus-1, clv3-2 и clv2-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генетическая характеристика мутации fas5. Мутация fas5 (линия М-21-1) получена на основе расы Dijon (линия К-1) на кафедре генетики МГУ с помощью химического мутагенеза этилметанс-ульфоната и наследуется как ядерная рецессивная. Тесты на аллелизм с ранее изученными мутациями, приводящими к фасциации стебля, показали, что мутация fas5 не является аллелью генов CLV1, CLV2, CLV3 и FAS1. Отсутствие аллелизма с геном FAS2 установлено путем секвенирование кДНК из мутанта fas5 и родительской расы Dijon. Выявлено сцепление fas5 с маркерами lfy-10 и yi, расположенными в нижнем плече хромосомы 5 в районе 79сМ и 85сМ, соответственно. Сила сцепления между fas5 и yi составила 5.7 ± 1 сМ и между fas5 и lfy-10 — 2.7 ± 0.5 сМ. Поскольку расстояние между генами YI и LFY составляет 3 сМ, сделан вывод о локализации гена FAS5 в хромосоме 5 A. thaliana левее гена LFYв районе 76 сМ, где не описаны гены, мутации которых вызывают фасциацию.
Анализ генных взаимодействий с помощью изучения фенотипа двойных мутантов. Для выявления взаимодействий генов использованы мутанты clv3-2 (CS8066), clv2-1 (CS46) и wus-1 (CS15) из Arabidopsis biological Resource Center. Поскольку мутация clv3-2 (CS8066) была получена на основе линии Ler, содержащей мутацию er, тесно сцепленную с clv3-2, двойной мутант fas5 clv3-2 всегда был гомозиготен по er (по сути, представлял собой тройной мутант). В связи с этим для коррект-
ного сравнения с двойным мутантом fas5 clv3-2 мутант fas5 путем скрещиваний с Ler был переведен на тот же генетический фон. Для получения двойных мутантов fas5 clv2-1 и fas5 wus-1 сначала путем скрещиваний с расой Dijon получали мутанты clv2-1 и wus-1 без мутации erl, после чего их скрещивали с мутантом fas5.Для анализа морфологии растения выращивали в смеси почвы и песка (2 : 1) в условиях теплицы на длинном дне.
Документирование материала. Съемки растений проводили цифровым фотоаппаратом "Canon" (Япония) под бинокуляром Stemi 2000-C (Германия). Детальный анализ структуры органов проводили с помощью сканирующих электронных микроскопов JSM-6380LA и СЭМ S-405A (фирм Jeol и Hitachi, Япония, соответственно). Апикальные меристемы для СЭМ выделяли из растений на стадии цветения. Образцы инкубировали в растворе 70% этанола 16 часов при 4°С. Далее образцы переносили последовательно в растворы этанола 80% — 10 мин, и дважды 95% этанола — по 30 мин. Далее образцы инкубировали в смеси этанол 96% : ацетон 97% (1 : 1) в течение 30 мин и в 100% ацетоне в течение 2-х часов. Высушенные образцы прикрепляли к металлическим столикам, напыляли смесью палладия и платины в ионном напылителе IB-3 ("Eiko", Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние мутации fas5 на развитие побега
Отличия мутанта от растений дикого типа видны уже на ювенильной стадии развития по изменению формы листьев розетки. Листья мутанта fas5 уже, чем у растений дикого типа, листовая пластинка приобретает характерную ромбовидную форму (рис. 1а). На листьях мутанта можно видеть трихомы, имеющие 4 ветви (рис. 1б), в то время как у дикого типа встречаются трихомы максимум с 3-мя ветвями. В среднем, на третьем розеточном листе мутанта fas5 можно обнаружить 26% трихом с 2 ветвями, 42% — с 3 ветвями и 31% — с 4 ветвями. На третьем розеточном листе дикого типа 2 ветви имелось у 67% трихом, 3 — у 33%, а трихом с 4 ветвями не наблюдалось. Клетки поверхности листовой пластинки fas5 характеризуются существенно большим разбросом размеров, чем у дикого типа. Среди них можно заметить крупные клетки, не встречающиеся у растений дикого типа (рис. 1в, 1г). Образование таких клеток у мутанта, а также увеличение степени раз-ветвленности трихом указывают на более ранний переход клеток к эндоредупликации ДНК (удвоение ДНК без последующего деления клетки), приводящий к возникновению более крупных полиплоидных клеток.
Число розеточных листьев у мутанта снижено (таблица), что связано с более ранним образованием цветоноса. Число вегетативных узлов цвето-
Рис. 1. Морфология розеточных листьев мутанта/а85 и растений дикого типа: (а) — общий вид розеточных листьев (слева-направо) дикого типа и мутанта fas5; (б) — аномально разветвленная трихома на поверхности листа^5; (в, г) — верхняя сторона листовой пластинки fas5 и дикого типа соответственно.
носа со стеблевыми листьями у мутанта несколько увеличено, но эти различия не достоверны. По высоте цветоносов растения fas5 не отличаются от растений дикого типа (таблица).
Наиболее яркое проявление мутации fas5 — фасциация цветоноса — признак, который лег в
основу названия мутанта. Эта особенность связана с изменениями строения апикальной меристемы побега (АМП). АМП мутанта fas5 сильно увеличивается в размере по сравнению с АМП растений дикого типа (рис. 2а, 2б), что приводит к существенному разрастанию стебля в ширину
Сравнение морфометрических характеристик побега растений A. thaliana дикого типа (раса Dijon) и мутанта fas5
Показатель Dijon fas5
Число листьев розетки 8.2 ± 0.7 4.7 ± 0.6*
Высота побега 40.8 ± 4.8 43.8 ± 3.2
Высота вегетативной части Число узлов вегетативной части 20.5 ± 2.2 3.6 ± 0.65 22.0 ± 2.8 5.73 ± 1.02
Высота генеративной части Число узлов генеративной части
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.