БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 6, с. 435-441
УДК 575.853316.7: 576.316.7:582.542.1
ПЛОЩАДЬ ГЕТЕРОХРОМАТИЧЕСКИХ РАЙОНОВ В ЯДРАХ И ХРОМОСОМАХ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНОМА
КУЛЬТУРНОГО ЛЬНА
© 2007 г. О. В. Муравенко, Т. Е. Саматадзе, К. В. Попов, О. Ю. Юркевич, И. В. Носова,
Н. Л. Большева, А. В. Зеленин
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32; тел.: (495)135-04-39; факс: (495)135-14-05; электронная почта: chrom@eimb.ru Поступила в редакцию 18.07.2007 г.
Проведен статистический анализ суммарного содержания С-гетерохроматина (площадь темноокра-шенных районов) в профазных ядрах и метафазных хромосомах восьми сортов культурного льна ^тыт usitatissimum L.): Шафир, Оливер, Линотт (масличные сорта); Оршанский-2, Белинка, Балту-чай (льны-долгунцы современной селекции); Зарецкий кряж, К-37 (стародавние сорта льна-долгунца). Установлено, что кариотипы сортов льна разного направления селекции различаются по содержанию гетерохроматина: количество гетерохроматина в масличных сортах больше, чем в сортах, относящихся к группе льнов-долгунцов. Показано, что геномный полиморфизм по С-гетерохрома-тиновым маркерам отражает селекционную направленность сортов льна. Простой тест на суммарное содержание С-гетерохроматина в профазных ядрах может быть использован для сравнительного экспресс-анализа, позволяющего отбирать образцы с заданными свойствами в процессе создания новых сортов растений.
Современные цитогенетические методы позволяют использовать для изучения кариотипов растений целый набор хромосомных маркеров. К наиболее информативным и часто применяемым методам относятся С-дифференциальное окрашивание конститутивного гетерохроматина, флу-орохромное окрашивание, выявляющее AT- и GC-богатые районы хромосом, а также флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), которая позволяет проводить физическое картирование различных последовательностей ДНК на хромосомах. Все перечисленные маркеры служат не только для характеристики геномов отдельных видов растений, но и хорошо отражают внутривидовой полиморфизм подвидов, разновидностей и сортов, которые могут произрастать в разных эколого-географиче-ских районах [1-8].
Обычно при сравнительном исследовании рисунков С-дифференциального окрашивания хромосом выявляются кариотипические различия культурных видов растений, отбор которых направлен на создание сортов, имеющих хозяйственно-ценные признаки и районированных в определенных эколого-географических зонах. Такие исследования проводят, как правило, на видах растений с крупными хромосомами и большим числом гетерохроматиновых бэндов, что позволяет выявлять хромосомные маркеры, специфичные для кариотипов сортов разного направления селекции и таким образом ускорять селекционный процесс [9-12].
Потребность в использовании хромосомных маркеров, отражающих индивидуальные особенности сорта, очевидна и для мелкохромосомных видов. В хромосомах таких растений, как правило, гетерохроматина мало, и локализуется он прицен-тромерно, поэтому идентификация хромосом затруднительна [7]. Недавно с этой целью был разработан комплекс методов, адаптированных для исследования хромосом малых размеров, что позволило сравнить кариотипы разных сортов ромашки и льна [4, 5, 7, 8, 13-15]. Однако такая работа, проводимая с помощью компьютерного анализа изображения индивидуальных хромосом в кариотипах, весьма трудоемка, что препятствует широкому использованию этих методов в практической генетике и селекции.
Целью данного исследования было выяснение возможности оценки суммарного содержания С-гетерохроматина в хромосомах и ядрах сортов льна, относящихся к различным разновидностям. Ранее мы обнаружили, что абсолютные размеры гетерохроматических сегментов в мелких хромосомах льна в митозе практически постоянны [16], а идентификация хромосом у льна сложна из-за малого числа интеркалярных блоков. В связи с этим для определения суммарного гетерохроматина мы использовали общую площадь всех С-блоков, выявляемых в хромосомах и профазных ядрах. В качестве дополнительных маркеров для сравнительного исследования кариотипов использовали флу-
и
Рис. 1. С-дифференциально окрашенные метафазные пластинки хромосом сортов разных разновидностей льна (а - лен-долгунец сорт Балтучай; б - лен масличный сорт Шафир). Масштабная черта - 5 мкм.
а
оресцентную гибридизацию рибосомных генов на хромосомах.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материал. Материалом для исследования послужили семена различных разновидностей культурного льна (Linum usitatissimum L.), полученные из Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси (Минск): пяти сортов льна долгунцового типа (L. usitatissimum var. usitatissimum cv.) - K-37, Оршанский-2, Белинка, Балтучай, Зарецкий кряж; двух сортов льна масличного (L. usitatissimum var. humile Mill) - Шафир, Оливер; сорта Линотт, принадлежащего к межеумкам (L. usitatissimum subsp. intermedium Czer.).
Приготовление хромосомных препаратов. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при комнатной температуре. Корешки длиной 0.5 см отрезали и инкубировали в растворе 9-аминоакридина (1мкг/мл, "Sigma", США) при температуре 0°С в течение 16-20 ч. Корешки фиксировали в течение 3 сут в фиксаторе Карнуа 3 : 1 (этанол : ледяная уксусная кислота) при комнатной температуре. С-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом и профазных ядер, анализ рисунков окрашивания С-блоков проводили по описанным ранее методикам [4, 5, 13, 15]. Хромосомные препараты для FISH готовили на предметном стекле. Меристему корешка отрезали, мацерировали в капле 45% уксусной кислоты и раздавливали под покровным стеклом. После замораживания в жидком азоте снимали покровное стекло и помещали препарат в 96% этанол. Приготовление проб и гибридизацию in situ осуществляли согласно описанной ранее методике [17].
Хромосомный анализ. Метафазные пластинки анализировали с помощью микроскопов Leitz Wetzlar и Olympus BX61, оборудованных черно-белыми CCD-камерами CoolSnap ("RoperScientific Inc.",
США). В качестве меры содержания гетерохрома-тина использовали площадь темноокрашенных областей ядра и хромосом, которую определяли, используя компьютерные программы анализа изображения Карио 1.5 (ВидеоТест, Санкт-Петербург) и ImageJ 1.38 (www. rsb.info.nih.gov/ij/). Тем-ноокрашенные области выделяли с помощью процедуры яркостной сегментации. В каждом образце анализировали не менее 15 метафазных пластинок, в которых хромосомы находились в оптимальном интервале спирализации [16], и 50 профазных ядер.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. Проведено С-дифференциальное окрашивание хромосом сортов разных разновидностей льна. Сравнительный анализ рисунков С-окраски хромосом показал, что в кариотипах всех сортов распределение С-блоков по длине хромосом было сходным. У сортов льна-долгунца рисунок С-окраски хромосом отличался от рисунка у масличных сортов меньшими размерами прицен-тромерных С-блоков и присутствием теломерных бэндов на большинстве хромосом. У всех сортов льна интеркалярные С-бэнды были полиморфными по размеру, хотя у долгунцов эти С-блоки имели обычно большие размеры, чем у масличных сортов (рис. 1).
Суммарное содержание С-гетерохроматина в метафазных хромосомах. Определено общее количество гетерохроматина (суммарная площадь темноокрашенных С-бэндов) в метафазных хромосомах исследуемых сортов льна. Результаты анализа представлены на рис. 2. Сравнение средней суммарной площади гетерохроматина в хромосомах разных сортов показало, что сорта можно разделить на две группы. В одну группу вошли сорта льнов-долгунцов и межеумков, а в другую - мас-
S, усл. ед. 10 г
F(S)
0
{ { ä
1 2
3
4 5
6
7 8
Рис. 2. Средняя суммарная площадь гетерохроматина и ее дисперсия на метафазных хромосомах. Лен-долгунец: 1 - К-37; 2 - Зарецкий кряж; 3 - Балтучай; 4 - Белинка; 5 - Оршанский-2. Лен-межеумок: 6 - Ли-нотт. Лен масличный: 7 - Оливер; 8 - Шафир.
0 4 8 12 16
S, усл. ед.
Рис. 3. Функции распределения площади гетерохроматина измеренной на препаратах профазных ядер льна долгунцового (Оршанский-2) и льна масличного (Шафир).
4
2
личные сорта. Таким образом, сорта льна масличного характеризуются большим содержанием гетерохроматина по сравнению с сортами других разновидностей.
С-дифференциальное окрашивание профазных ядер. Получение большого числа метафазных пластинок, пригодных для цитогенетического анализа, у льна связано с рядом трудностей. В то же время профазных ядер на препаратах всегда достаточно для статистического анализа. По этой причине мы дополнительно провели статистический анализ средней суммарной площади гетерохроматина С-дифференциально окрашенных профазных ядер у масличного сорта Шафир и сорта льна-долгунца Оршанский-2, чтобы выяснить возможность использования этого показателя при сравнительном анализе сортов разных разновидностей льна. Показано, что функции распределения средней суммарной площади гетерохроматина профазных ядер различаются у сортов Шафир и Оршан-ский-2 (рис. 3). Различия наблюдаются как по площади, так и по дисперсии распределения площади гетерохроматина (таблица). Из таблицы видно, что результаты измерения суммарных площадей гетерохроматина на хромосомных препаратах и на
препаратах профазных ядер масличного сорта Шафир и долгунцового сорта Оршанский-2 в целом согласуются. Средняя площадь гетерохроматина и дисперсия ее распределения у сорта Оршанский-2 меньше как на хромосомах, так и на ядрах.
Локализация генов 5S и 26S рРНК. У всех сортов льна FISH с 26S и 5S рДНК-пробами выявила основной сайт совместной локализации генов рРНК на спутничной хромосоме. Сайты 5S рДНК картированы на трех парах хромосом. У масличных сортов льна и у межеумка на хромосомах обычно выявлялись более интенсивные сигналы гибридизации 26S и 5S рДНК по сравнению с сортами льна-долгунца. В кариотипах льна-долгунца (Белинка) внутрисортовой полиморфизм интенсивности сигналов гибридизации 5S рДНК был выше, чем у масличного сорта (Шафир) (рис. 4).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полиморфизм гетерохроматич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.