По химии — Ш.Хелль, У.Мернер, Э.Бетциг
Нобелевскую премию по химии за разработку флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения получили три исследователя: Штефан Хелль (Германия), Уильям — Мернер (США) и Эрик Бетциг (США).
Немецкий физик Штефан Хелль (Stefan W. Hell) родился в 1962 г. в г.Сынтана (Румыния), а в 1979 г. эмигрировал с родителями в ФРГ. Там он поступил в Гейдельбергский университет, где получил степень доктора по физике. В 1996 г. стал профессором физики, а в 2002 г. — директором Института биофизической химии общества Макса Планка (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) в Геттингене. Там он основал отдел нанобиофото-ники, а в 2003 г. возглавил отдел оптической нано-скопии в Немецком центре по исследованию рака в Гейдельберге.
Второй лауреат, Уильям Мернер (William E.Moerner), родился в Калифорнии в 1953 г. Окончив Университет Вашингтона в Сент-Луисе (штат Миссури), получил с отличием три степени бакалавра: по физике, электротехнике и математике, а докторскую степень по физике — в Корнелль-ском университете. Затем работал в компании IBM, в Калифорнийскам университете в Сан-Диего ив Гарвардском университете. В 1998 г. вместе со своей группой перешел в Стэнфордский университет, где в настоящее время руководит химическим факультетом.
Американский физик-экспериментатор, изобретатель и инженер Эрик Бетциг (Eric Betzig) родился в г.Энн Арбор (штат Мичиган) в 1960 г. По окончании Калифорнийского технологического института получил степень доктора прикладной физики и инженерии в Корнелльском университете. Работал в лаборатории «Белл», а затем на станкостроительном заводе своего отца «Ann Arbor Machine Company» в г.Челси (штат Мичиган), после чего, решив вернуться в науку, по его же словам, «укрылся в своей хижине и начал думать». В результате разработал новые технологии оптической микроскопии и воплотил их в жизнь в исследовательском кампусе «Джанелия» при Медицинском институте Говарда Хьюза (штат Мэриленд), где сейчас возглавляет лабораторию.
Итак, Нобелевская премия по химии вручена трем физикам за разработку прикладных методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, очень важных прежде всего в биологии и медицине. Это говорит не только об актуальности междисциплинарных исследований, но и о значении микроскопической техники в современной науке.
Действительно, важность такого прибора, как микроскоп, трудно переоценить. Достаточно вспомнить хотя бы его роль в открытии возбудителя чумы. Эта «черная смерть» буквально выкашивала в средние века население Европы. Все по-
пытки бороться с эпидемиями ни к чему не приводили до тех пор, пока не изобрели микроскоп и не открыли чумную бактерию Yersiniapestis. Совершенно очевидно, что ни одно изобретение не спасло столько жизней, сколько микроскоп в руках микробиологов и врачей. Все это блестяще описано в многократно переизданной книге Поля де Крюи «Охотники за микробами» (СПб., 2006).
Микроскоп позволил открыть микромир, бороться с болезнями, изучать живые клетки и многое-многое другое. Однако возможности микроскопа с момента его изобретения и до начала XXI в. были ограничены так называемым дифракционным пределом. Смысл его состоит в том, что в любой оптической системе из-за дифракции света объекты меньше определенного размера (примерно половины длины световой волны, т.е. около 0.2 мкм) увидеть невозможно. Это было доказано немецким физиком Эрнстом Аббе [1]. Выведенная им формула дифракционного предела имеет настолько важное значение в оптике, что ее факсимиле выбито на памятнике Аббе в Йене:
В этой формуле й — минимальный размер объекта, который теоретически можно увидеть с помощью увеличивающей оптической системы, состоящей из линз, X — длина световой волы, п — коэффициент оптического преломления среды, заполняющей пространство между объектом и объективом, а — угол, под которым свет от объекта заходит в оптическую систему (точнее, половина этого угла, ограниченная оптической осью системы). Если взять коротковолновый свет (синий, с длиной волны 500 нм), самое большое значение коэффициента преломления (1.51 для иммерсионного масла, используемого с высокоапер-турными объективами) и теоретически максимально возможный угол 90°, когда объект находится в плоскости входного зрачка оптической системы (б1п90° = 1), то по формуле Аббе окажется, что теоретически увидеть в микроскоп ничего меньше 166 нм нельзя. На практике это значение достигает 200 нм, а значит все, что меньше (большинство внутриклеточных органелл, не говоря уже о биомолекулах), увидеть невозможно, как бы мы ни совершенствовали оптическую систему.
Со времени расчета дифракционного предела не прекращались попытки его обойти. Первые результаты относятся к 40-м годам ХХ в., когда были открыты флуорофоры, или флуорохромы. Эти органические вещества под действием света определенной длины волны (возбуждающего света) начинали светиться светом другой, обычно большей длины волны (возбужденным светом). Первым открыли хорошо известный теперь флуоресцеин, который при действии синего света светился
зеленым. Таким образом, если окрасить объект флуоресцеином, осветить синим светом, а перед глазами (или перед фотоаппаратом) поставить зеленый светофильтр, который задержит отраженные от объекта синие лучи и пропустит зеленые, то мы увидим (сфотографируем) только интересующий нас объект, и ничего больше. Подробнее о дифракционном барьере и флуоресцентной микроскопии [2].
Флуорохромы дали исследователям совершенно новые возможности: если можно покрасить флуорохромом интересующий объект и заставить его светиться, то неважно, какого он размера. При достаточно ярком свечении объект будет видим. Так появилась флуоресцентная микроскопия (рис.1). Источником света в этом методе служит сам объект исследования (внутриклеточные орга-неллы, белки, бактерии и т.д.), а все, что нас не интересует, не светится и не мешает. Появление во второй половине ХХ в. флуоресцентных микроскопов и многочисленных флуоресцентных красителей, избирательно заставляющих светиться разным цветом различные органеллы, белки, мембраны и многое-многое другое, дали колоссальный толчок развитию медико-биологических исследований и диагностики.
Однако две проблемы портили радостную картину. Во-первых, у каждого оптического прибора, включая микроскоп, есть плоскость фокуса, и рассеянный свет от структур, расположенных вне этой плоскости, мешал разглядеть то, что в фокусе. Во-вторых, дифракционный предел никуда не делся, и изображения всех светящихся структур с размерами, меньшими этого предела (приблизительно 200 нм), превращались в пятно размером в те самые 200 нм. Если же расстояние между двумя
Рис.1. Принцип флуоресцентного микроскопа. Свет (1) от источника (обычно это ртутная лампа) проходит сквозь возбуждающий синий светофильтр (2), попадает на свето-делительную пластину-бимсплиттер (3), которая отражает синие лучи и пропускает зеленые, отражается от нее, идет в объектив микроскопа (4) и освещает объект (5). Молекулы флуорохрома начинают светиться, их изображение идет через объектив, проходит сквозь бимсплиттер и фокусируется в глаз исследователя.
структурами было меньше дифракционного предела, то микроскоп видел их как одну.
Первую проблему решил американский физик Марвин Мински (Marvin Lee Minsky), который в 1961 г. запатентовал принцип сканирующего конфокального (confocal — софокусный) флуоресцентного микроскопа. Именно на его основе Хелль создал свою систему сверхвысокого разрешения, поэтому про сканирующий конфокальный микроскоп необходимо рассказать подробнее.
Современные микроскопы этого типа называются лазерными сканирующими конфокальными микроскопами (рис.2). В них источником возбуждающего света, который должен осветить объект и заставить светиться флуорохром, служит лазер. Этот мощный источник испускает пучок параллельных монохромных когерентных (т.е. одинаковых) лучей, что делает такой пучок идеальным для манипулирования с помощью линз. Оптическая система микроскопа отправляет пучок последовательно на два зеркала, сидящих на осях управляемых компьютером гальванометрических шаговых электродвигателей, а затем в объектив микроскопа. Пройдя через объектив, луч фокусируется строго в плоскости фокуса микроскопа в маленькую точ-
Рис.2. Принцип лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Луч синего лазера (1) проецируется на свето-делительную пластину-бимсплиттер (2), которая отражает синие лучи и пропускает зеленые, отражается от нее, проходит последовательно два сканирующих зеркала (3, 4), идет в объектив микроскопа (5) и фокусируется в очень маленькое ограниченное дифракцией пятно в плоскости фокуса объекта (Р). Возбужденная зеленая флуоресценция из точки в плоскости фокуса проходит через объектив, сканирующие зеркала и бимсплиттер и проецируется в центр конфокальной диафрагмы-пинхол (6), сопряженной с плоскостью фокуса (Р'). Пройдя за пинхол, свет проецируется на фотодетектор (7), замеряющий яркость свечения флуорохрома в ограниченном дифракцией пятне. Светящаяся структура, расположенная в плоскости Р1 вне плоскости фокуса Р, проецируется в плоскость Р1', отличную от плоскости Р', и свет от нее не проходит за пинхол. Таким образом, отсекается флуоресценция всех структур вне плоскости фокуса.
ку, называемую ограниченным дифракцией пятном (те самые 200 нм). По команде компьютера электромоторы перемещают луч (один вдоль оси X, другой вдоль оси Y), и это маленькое пятно может свободно двигаться в плоскости фокуса XY.
Если в объекте есть молекулы флуорохрома, а длина волны лазера соответствует таковой света, возбуждающего свечение такого вещества, то в точке, в которой находится это пятно, флу-орохром начнет светиться. Однако светиться он будет не только в этой точке (называемой фокальным объемом), но также и выше, где луч был еще расфокусирован, и ниже, где луч уже расфокусирован. Таким образом, флуорохром будет светиться в фокальном объеме и внутри двух конусов, которые сходятся в нем вершинами.
Свет от флуорохрома через объектив и оптическую систему микроскопа проецируется в очень маленькое отверстие диафрагм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.