БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2005, том 31, № 6, с. 429-434
УДК 757.7:591.52:577.472 БИОЛОГИЯ ОБРАСТАНИЯ
ПОДАВЛЕНИЕ ОСЕДАНИЯ ЛИЧИНОК ОБРАСТАТЕЛЕЙ ВОДОРАСТВОРИМЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ МОРСКИХ ЭПИБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ1
© 2005 г. С. В. Добрецов
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург 199034 e-mail: sergey_dobretsov@yahoo.com
Статья принята к печати 14.02.2005 г.
С поверхности зеленой водоросли Ulva reticulata (Forssk, 1775), мягкого коралла Dendronephthya sp. и губки Haliclona sp. выделены 29 штаммов бактерий. Установлено, что пленки бактерий Vibrio alginolyticus, Vibrio sp. 4, штамм неидентифицированной а-протеобактерии, Vibrio sp. 7, Pseudoalteromonas sp. 2 и Pseudoalteromonas sp. 4 подавляли оседание личинок полихеты Hydroides elegans (Haswell, 1883) и мшанки Bugula neritina (Linnaeus, 1758). Водные экстракты пяти бактерий, за исключением Pseudoalteromonas sp. 2, препятствовали оседанию личинок. Впервые установлено, что бактерии V. alginolyticus, Vibrio sp. 4 и неидентифицированная а-протеобакте-рия выделяют высокомолекулярные (> 100 кДа) химические соединения, препятствующие оседанию личинок. Обработка соединений амилазой ингибировала их активность, тогда как пепсин и папаин не влияли на активность соединений. Полученные данные свидетельствуют о том, что бактерии, живущие на поверхности ряда морских организмов, могут выделять водорастворимые сахаросодержащие соединения, препятствующие оседанию личинок.
Ключевые слова: морское обрастание, бактерии, химическая защита, эпибиоз, оседание, личинки.
Water-soluble compounds from marine epibiotic bacteria inhibit the settlement of larvae of fouling organisms. S. V. Dobretsov (Biological Faculty, Saint Petersburg State University, St. Petersburg 199034)
Twenty-nine bacterial strains were isolated from the surface of the green alga Ulva reticulata, the soft coral Dendronephthya sp., and the sponge Haliclona sp. Only 6 species (Vibrio alginolyticus, Vibrio sp. 4, an unidentified а-Proteobacterium, Vibrio sp. 7, Pseudoalteromonas sp. 2, and Pseudoalteromonas sp. 4) inhibited the settlement of the tubeworm Hydroides elegans (Haswell, 1883) and the bryozoan Bugula neritina (Linnaeus, 1758). Aqueous extracts of 5 bacterial strains, with the exception of Pseudoalteromonas sp., interfered with larval settlement. V. alginolyticus, Vibrio sp. 4, and an unidentified а-Proteobacterium produced high molecular mass (> 100 kDa) antifouling compounds. Amylase treatment inhibited their activity, while trypsin and papain had no effect on the activity of these compounds. The results indicate that epibiotic bacteria from some marine organisms produce water-soluble, sugar-like antifouling compounds. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2005, vol. 31, no. 6, pp. 429-434).
Key words: marine biofouling, bacteria, chemical defense, epibiosis, settlement, larvae.
Поверхность любого опущенного в море субстрата, как правило, сначала колонизируется микрообраста-телями (преимущественно бактериями и микроводорослями), а позднее и макрообрастателями (личинками беспозвоночных и спорами макроводорослей) (Раил-кин, 1998). Развиваясь, биообрастание приводит к износу поверхности материала, усилению коррозии и увеличению расхода топлива судов (Резниченко и др., 1976). Ущерб от обрастания судов, причалов, платформ и оборудования, работающего в воде, в мировом масштабе составляет около 50 млрд. долларов в год (Зевина, 1994). Универсальных средств защиты от обрастания, которые бы не отравляли окружающую среду, до сих пор не существует (Серавин и др., 1985; Ра-илкин, 1998), поэтому в настоящий момент насущной задачей является поиск путей нетоксичной защиты от обрастания.
Личинки и споры обрастателей оседают на поверхность как искусственных субстратов, так и морских
организмов (Wahl, 1997). Процесс поселения рассели-тельных стадий обрастателей (эпибионтов) на поверхности живых организмов носит название эпибиоза. Многие прикрепленные или малоподвижные организмы, такие как губки, асцидии, мягкие кораллы и водоросли, часто используют химические вещества, убивающие или отпугивающие эпибионтов (Раилкин, 1998). Например, бурые водоросли Fucus vesiculosus и Laminaria saccharina препятствуют оседанию мидии Mytilus edulis, выделяя в воду репелленты (Dobretsov, 1999а; Добрецов, Раилкин, 2000), а нитчатые водоросли Cladophora sp. с помощью химических веществ инги-бируют оседание личинок обелии Obelia loveni (см.: Dobretsov, 1999b; Добрецов, 2000). В лабораторных экспериментах морская губка Callispongia pulvinata подавляла рост морских диатомовых водорослей и оседание личинок полихет, а в полевых условиях изменяла состав сообществ обрастания, находящихся в непосредственной близости от нее (Dobretsov et al., 2004).
'Работа выполнена при поддержке гранта для молодых кандидатов наук вузов Санкт-Петербурга (РБ № 02-4-190).
Ранее было высказано предположение, что индукторы оседания личинок должны быть водорастворимыми соединениями, тогда как ингибиторы - слаборастворимыми низкомолекулярными соединениями, эффективными в низких концентрациях (Steinberg et al., 2001, 2002). Действительно, фураноны, выделяемые красной водорослью Deliseria pulchra, эффективно препятствуют обрастанию (De Nys et al., 1991), а аминокислоты индуцируют оседание личинок устриц (Zimmer-Faust, Tamburri, 1994; Tamburri et al., 1996) и поли-хет (Harder, Qian, 1999).
Известно, что бактерии, входящие в состав пленки микрообрастания, способны привлекать личинок беспозвоночных и отпугивать их (Зевина, 1994; Орлов, 1996; Раилкин, 1998). Поэтому, вероятно, морские макроводоросли и прикрепленные беспозвоночные могут подавлять развитие обрастания на своей поверхности как непосредственно (с помощью химических веществ), так и опосредованно (с помощью бактерий, живущих на их поверхности). Установлено, что бактерии, изолированные из асцидии (Holmstrom, Kjelleberg, 1999) и губки (Lee, Qian, 2003), подавляют оседание личинок в лабораторных условиях. В нашей работе использованы бактерии, выделенные с поверхности нескольких организмов: зеленой водоросли Ulva reticulata, мягкого коралла Dendronephthya sp. и губки Haliclona sp. Действие бактерий анализировали в экспериментах по оседанию личинок полихеты Hydroides elegans и мшанки Bugula neritina - массовых обрастателей тропических вод (Зе-вина, 1994).
Задачи данного исследования: 1) изолировать бактерии с поверхности U. reticulata, Dendronephthya sp. и Haliclona sp.; 2) изучить действие бактериальных пленок и водных экстрактов бактерий на оседание личинок H. elegans и B. neritina; 3) определить молекулярную массу и некоторые свойства противообрастательных веществ, выделяемых бактериями.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Получение бактерий
Бактерий выделяли в лаборатории с поверхности водоросли Ulva reticulata, мягкого коралла Dendronephthya sp. и губки Haliclona sp. согласно методике Хардера с соавторами (Harder et al., 2003). Для этого поверхность организмов протирали стерильным ватным тампоном, который помещали в автоклавированную морскую воду (АМВ). Затем суспензии бактерий разводили в 100 и 1000 раз и высевали на морской агар (Marine agar 2216), который инкубировали в течение 3 сут при 30°С. Различные по морфологическим признакам колонии изолировали, в дальнейшем их идентифицировали с помощью анализа последовательностей 16S р-РНК с использованием базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Изоляты хранили в 50% растворе глицерина при температуре -80°С. Перед началом экспериментов бактерии выращивали в течение 1-3 сут на морском бульоне (5 г пептона и 3 г дрожжевого экстракта на 1 л морской воды) при температуре 30°С.
Получение личинок
Взрослых полихет Hydroides elegans и колонии мшанки Bugula neritina собирали с канатов, погруженных в воду на
глубину 5 м, в районе рыбного хозяйства Йонг Шин Оу (Yung Shue O), Гонконг. В лаборатории животных помещали в небольшие хорошо аэрируемые аквариумы с отфильтрованной морской водой (температура воды 25°С). Личинок получали и содержали в соответствии с методикой Брайана с соавторами (Bryan et al., 1997). В эксперименте использовали только готовых к оседанию личинок.
Формирование бактериальных пленок и получение водных экстрактов бактерий
Формирование пленок бактерий проводили по методике Лау и Чена (Lau, Qian 1997). Клетки бактерий, находящихся в фазе стационарного роста, отделяли от питательной среды с помощью центрифугирования (6000 g в течение 15 мин). Клетки бактерий несколько раз отмывали и ресуспензировали в АМВ. Суспензию бактерий переносили в чашку Петри, которую инкубировали в течение 3 ч, давая бактериям прикрепиться к поверхности чашки. Затем содержимое чашки выливали, а чашку споласкивали АМВ, удаляя неприкрепленные клетки бактерий. Все операции производили в стерильных условиях. Чашку использовали для лабораторных экспериментов либо для приготовления водного экстракта бактерий. Для этого в чашку Петри с бактериальной пленкой добавляли АМВ и инкубировали в течение 12 ч, после чего водный экстракт собирали. Экстракт пропускали через фильтр (диаметр пор 0.22 мкм) и либо использовали в экспериментах, либо замораживали для дальнейшего хранения (-20°С).
Лабораторные эксперименты с личинками
Противообрастательное действие бактерий и их водных экстрактов изучали в лабораторных экспериментах с личинками H. elegans и B. neritina. Для этого в чашки Петри, содержащие бактериальную пленку, добавляли 5 мл АМВ и 20 личинок. В чашки с 5 мл экстракта также отсаживали по 20 личинок. В качестве контроля использовали АМВ. Эксперименты проводили в пяти повторностях. Оседание личинок полихет стимулировали с помощью раствора изобутилме-тилксантина (ИБМК) в концентрации 10 4М (Lau, Qian, 1997). В опыте с H. elegans количество прикрепившихся личинок подсчитывали через 24 ч, а с B. neritina - через 1 ч. В конце эксперимента подсчитывали число бактерий в чашке Петри с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Axiophot, Zeiss). ДНК бактерии окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом.
Для выделения противообрастательных веществ бактерий экстракты разделяли на различные молекулярные фракции
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.