МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 244-249
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 575.113.2
ПОИСК АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТЫ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ, С РАЗВИТИЕМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПОЛИНЕЙРОПАТИИ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 1
© 2004 г. Е. В. Зотова*, К. В. Савостьянов, Д. А. Чистяков, Т. Р. Бурса1, И. В. Галеев1,
И. А. Строков1, В. В. Носиков
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 1Кафедра эндокринологии и диабетологии Российской медицинской академии постдипломного образования;
Центр Всемирной организации здравоохранения по информатике в области диабета, Москва, 125315
Поступила в редакцию 20.06.2003 г.
Проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих ферменты антиокислительной защиты, у больных сахарным диабетом типа 1 с диабетической полинейропатией и без диабетической полинейропатии. Группы больных (всего 180 человек) формировали по принципу неперекрывающихся ("полярных") фенотипов. В группу "ДПН+" (n = 86) вошли больные с диабетической полинейропатией и длительностью сахарного диабета типа 1 не более 5 лет. Контрольную группу "ДПН-" (n = 94) составили лица без клинического диагноза диабетическая полинейропатия, болеющие сахарным диабетом типа 1 на протяжении 10 и более лет. Сравнительный анализ с использованием точного критерия Фишера выявил достоверные различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного маркера Т(-262)С гена САТ. Полиморфные маркеры С1167Т гена САТ, Pro/Leu гена GPX1 и 0/+ генов GSTT1 и GSTM1 не показали достоверных различий в распределении аллелей и генотипов, что свидетельствует об отсутствии ассоциации между данными полиморфными маркерами и диабетической полинейропатией в изученных нами группах больных.
Ключевые слова: сахарный диабет типа 1, диабетическая полинейропатия, окислительный стресс, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатион-Б-трансфераза, полимеразная цепная реакция, человек.
Диабетическая полинейропатия (ДПН) относится к так называемым поздним сосудистым осложнениям сахарного диабета (СД). При ДПН происходит повреждение нервной ткани: нарушается чувствительность периферийных нервов, ухудшаются скорость проведения нервного импульса и кровоснабжение нервной и мозговой ткани вследствие уменьшения скорости кровотока и дисфункции эндотелия сосудов. Одной из главных причин данных нарушений считается окислительный стресс, развивающийся вследствие длительной гипергликемии.
Увеличение концентрации глюкозы в кровяном русле больных СД приводит к повышению ее концентрации внутри клеток многих тканей, в том числе эндотелия и нейронов. Повышенная концентрация глюкозы в клетках в свою очередь активизирует гликолиз и цикл трикарбоновых кислот. Активизация цикла трикарбоновых кислот увеличивает градиент концентрации протонов на внутренних мембранах митохондрий [1, 2]. Превышение определенного порогового значе-
* Эл. почта: lena-zotova@mail.ru; nosikov@genetika.ru
ния мембранного потенциала вызывает резкое увеличение скорости образования супероксидного радикала - побочного продукта окислительного фосфорилирования. В условиях гипергликемии содержание в митохондриях и цитоплазме клеток супероксидного радикала значительно увеличивается, что способствует образованию других типов свободных радикалов и продуктов перекисного окисления [1, 2]. Это является главной причиной необратимых изменений в митохондриях нейронов и клеток эндотелия, которые выражаются в повреждении митохондриальной ДНК, нарушении работы ферментных комплексов, обеспечивающих синтез АТР, и, в конечном счете, в существенном уменьшении выработки энергии, необходимой клетке для эффективного функционирования. Окислительный стресс является также основной причиной ускоренного окисления мембранных липидов, что приводит к нарушению структуры и целостности миелиновой оболочки нервов и вызывает миелинопатию [3].
В процессе эволюции у эукариот возникло несколько типов ферментов, инактивирующих свободные радикалы и перекиси. К основным фер-
ментам антиокислительнои системы относятся супероксиддисмутазы [КФ 1.15.1.1], каталаза [КФ 1.11.1.6], глутатионредуктаза [КФ 1.6.4.2], глута-тионпероксидаза [КФ 1.11.1.9] и глутатион-S-трансферазы [КФ 2.5.1.18].
Каталаза - один из основных ферментов анти-окислительноИ защиты. Этот фермент, обнаруженный в пероксисомах клеток печени, почек и в эритроцитах, катализирует реакцию распада перекиси водорода до воды и свободного кислорода. В цитоплазме клеток эта реакция катализируется глутатионпероксидазоИ [4]:
2Н202 ^ 2Н20 + 02 Н202 + 2G-SH ^ 2Н20 + G-S-S-G.
Глутатион^-трансфераза (GST) объединяет несколько родственных ферментов, ответственных за метаболизм широкого спектра ксенобиотиков и канцерогенов [5]. Эти ферменты катализируют взаимодеИствие глутатиона с различными органическими соединениями с образованием ти-оэфиров, которое иногда является первым шагом в цепноИ реакции детоксикации, ведущеИ к образованию меркаптидноИ кислоты [6]. 0кислитель-ныИ стресс, развивающиИся при СД типа 1, влияет на активность и содержание данных ферментов в тканях [7]. 0пыты на крысах и мышах с экспериментальным диабетом выявили снижение в нерв-ноИ ткани активностеИ каталазы и глутатионпе-роксидазы, накопление окисленноИ формы глу-татиона и снижение концентрации глутатиона (восстановленноИ формы), играющего важнеИ-шую роль в инактивации свободных радикалов кислорода и перекиси водорода в организме [8]. Эти данные поддерживают предположение, что гены антиокислительных ферментов могут участвовать в становлении и развитии ДПН. До настоящего времени изучена ассоциация с ДПН только двух генов антиокислительных ферментов, а именно, генов, кодирующих митохондри-альную (SOD2) и внеклеточную (SOD3) супероксиддисмутазы. 0бнаружена ассоциация полиморфных маркеров этих двух генов с ДПН [9]. Ассоциация с ДПН генов САТ, GPX1, GSTT1 и GSTM1 до настоящего времени не изучалась.
Ген каталазы (CAT) состоит из 13 экзонов и расположен на хромосоме 11 (11р13) [10]. Недавно в этом гене обнаружены два полиморфных маркера. ПервыИ из них находится в экзоне 9 и представляет собоИ однонуклеотидныИ полиморфизм: остатки цитозина или тимина в положении 1167 (ё1167Т), не приводящиИ к аминокислотноИ замене [11]. ВтороИ маркер (Т(-262)С) расположен в промоторном раИоне и также представляет собоИ однонуклеотидныИ полиморфизм: остатки цитозина или тимина в положении -262 от участка инициации транскрипции [12]. В настоящеИ ра-
боте мы изучали ассоциацию этих маркеров с развитием ДПН у больных СД типа 1.
Ген глутатионпероксидазы 1 (GPX1) локализован на хромосоме 3 (3р21.3) и содержит два экзо-на [13]. Глутатионпероксидаза 1 синтезируется во всех тканях, но наибольшиИ уровень этого фермента наИден в эритроцитах, почках и печени [14]. Маркер Pro197Leu гена GPX1 представляет собоИ однонуклеотидныИ полиморфизм: остатки цитозина или тимина в положении 593, которому соответствует аминокислотныИ полиморфизм: остатки пролина или леИцина в положении 197 аминокислотноИ цепи [15]. Изучение трансгенных мышеИ, дефектных по гену GPX1, показало, что основная роль глутатионпероксидазы 1 заключается в защите от окислительного стресса, и дан-ныИ фермент исключительно важен для защиты неИронов от деИствия H2O2 в условиях in vitro [16].
Цитоплазматические глутатион^-трансфера-зы млекопитающих подразделяются на классы: а, ц, к, б, п, а. КаждыИ класс кодируется отдельным геном или семеИством генов.
Ген глутатион^-трансферазы M1 (GSTM1) локализован на хромосоме 1 (1р31). Позднее на тоИ же хромосоме картировали все пять генов глута-тион^-трансферазы M: GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4 и GSTM5 [17, 18].
Достаточно часто ген GSTM1 представлен так называемым нулевым аллелем, т.е. содержит протяженную делецию в кодирующеИ области. В таких генах нарушена рамка считывания мРНК, и в клетках человека с гомозиготным дефектом гена активныИ фермент не синтезируется. В некоторых популяциях GSTM1 не синтезируется более чем у 50% индивидов [19]. Показано, что отсутствие GSTM1 значительно увеличивает риск развития рака [20, 21].
Ген глутатион^-трансферазы T1 (GSTT1) [21] расположен на хромосоме 22 (22q11.2). Фермент GSTT1 обнаружен в эритроцитах, где он, возможно, участвует в процессах детоксикации. В гене GSTT1 так же, как и в гене GSTM1, часто обнаруживается обширная делеция в кодирующеИ области, у него также существует функционально не-активныИ нулевоИ аллель. Показано, что фермент GSTT1 не синтезируется в среднем у 38% индивидов [23]. При этом частота нулевого алле-ля гена GSTM1 выше у европеоидов, а нулевого аллеля гена GSTT1 - у негров [24].
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Группы больных были сформированы из числа пациентов отделения эндокринологии Цент-ральноИ клиническоИ больницы Министерства путеИ сообщения РоссиИскоИ Федерации (ЦКБ МПС РФ) и обратившихся на амбулаторныИ прием на кафедру эндокринологии РоссиИскоИ меди-
Таблица 1. Общая характеристика групп больных сахарным диабетом типа 1 с диабетической полинейро-патией ("ДПН+") и без диабетической полинейропа-тии ("ДПН-")
Показатель Группа "ДПН+" Группа "ДПН-"
Пол (М/Ж) 52/34 34/60
Возраст больных, лет* 25.5 ± 14.5 27.5 ± 8.5
Возраст больных к моменту 22.3 ± 6.3 12.0 ± 3.0
постановки диагноза СД типа 1,
лет*
Длительность СД типа 1, лет* 1.5 ± 1.4 15.5 ± 5.5
Гликозилированный 6.3 ± 1.5 7.1 ± 1.7
гемоглобин ИЪЛ1, %*
* Среднее ± S.D. (стандартное отклонение).
цинской академии постдипломного образования (РМАПО). Всего обследовано 180 больных СД типа 1, которых разбили на две группы по принципу неперекрывающихся ("полярных") фенотипов. В группу "ДПН+" вошли больные с длительностью СД типа 1 не более 5 лет и с ДПН. Контрольную группу "ДПН-" составили лица, больные СД типа 1 на протяжении 10 и более лет без клинического диагноза ДПН. Характеристики групп больных представлены в табл. 1. Диагноз ДПН ставился на основании пяти критериев согласно рекомендациям конференции по стандартизации в Сан-Антонио в 1992 г. и подкомитета "Нейроди-аб" [25-27].
Геномную ДНК выделял
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.