ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 533-535
УДК 663.18+549.695
ПОИСК ДРОЖЖЕЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БРАССИЛОВОЙ И СЕБАЦИНОВОЙ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
© 2004 г. И. В. Улезло, И. С. Рогожин
Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва 119071; e-mail: inbi @inbi.ras.ru Поступила в редакцию 25.12.2003 г.
Проведен скрининг культур дрожжей, относящихся к родам Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Debaryomyces, Hansenula, Pichia и Yarrowia, способных образовывать брассиловую и себациновую жирные кислоты. Испытано около 200 культур при выращивании на средах с деканом или тридека-ном в качестве единственных источников углерода. При культивировании на среде с тридеканом дрожжи синтезировали незначительное количество брассиловой кислоты. На среде с н-деканом более интенсивно образовывалась себациновая кислота. Отобрана культура Candida tropicalis, синтезирующая себациновую кислоту.
Алифатические дикарбоновые кислоты используются для получения полиамидов, полиуретана, пластификаторов, детергентов, ядохимикатов, смазок для авиационных двигателей, вакуумных насосов, при производстве синтетических волокон [1, 2].
Для получения дикарбоновых кислот химическим способом используют метод химического ди-терминального окисления н-алканов. Окисление парафинов до спиртов, карбонильных соединений, кислот происходит с увеличением температуры до 300°С и выше. При этом возможно образование взрывоопасных смесей углеводородов с кислородом воздуха. Для получения дикарбоновых кислот используют горчичное, рапсовое, касторовое масла [1].
При микробиологическом способе получения дикарбоновых кислот участвуют ферментные системы микроорганизмов, осуществляющие ди-терминальное окисление концевых метильных групп н-алканов, находящихся в а- и ю-положе-нии [3, 4]. Окислять длинноцепочечных н-алканы способны бактерии, дрожжи, грибы, но наибольшее количество патентов получено по дрожжам, имеющим наиболее активные ферментные системы [4].
Первый этап ферментативной реакции включает окисление терминальной метильной группы субстрата в соответствующий спирт. Эта реакция катализируется у дрожжей монооксигеназной системой, состоящей из двух компонентов - цито-хрома Р-450 и редуктазы, содержащей флавин-адениндинуклеотид и флавинмононуклеотид. Такие монооксигеназы есть у многих про- и эукариоти-ческих организмов [4].
Впервые микробиологический синтез дикарбоновых кислот был осуществлен Кестером и
Фостером в 1963 г. [5]. Многие дрожжи и бактерии имеют способность использовать длинноце-почечные н-алканы и жирные кислоты с образованием дикарбоновых кислот [6-8]. Поиск микроорганизмов-продуцентов жирных кислот ведется также среди морских дрожжей [9]. Для получения производственных штаммов применяют методы классической генетики, в результате чего выход дикарбоновых кислот у мутантов значительно повышен [10]. Первое место по производству дикарбоновых кислот биотехнологическим методом занимают японские фирмы [4, 11-13].
Цель работы - поиск культур среди дрожжевых организмов, способных к утилизации н-алка-нов( декана и тридекана) и образованию соответствующих дикарбоновых кислот - брассиловой и себациновой.
МЕТОДИКА
Все культуры дрожжей выращивали в течение 4 сут при 28-30°С на качалке (230 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 900 мл, содержащих 200 мл питательной среды. Среда 1 содержала (г/л дистиллированной воды): М§Б04 • 7 Н20 - 0.5; КаС1 - 0.1; СаС12 • 6Н20 - 0.05; КН2Р04 - 1.0; (КН4)2Б04 -0.3; дрожжевой экстракт - 0.2; 25 мл раствора микроэлементов следующего состава (мг/л): МпС12 - 40; №2Мо04 - 80; Си804 - 6; Н3В03 - 3; 2пБ04 - 60, рН 7.0. Среда 2 содержала (г/л дистилированной воды): КН4Н2Р04 - 2.0; М§Б04 • 7Н20 - 0.5; дрожжевой экстракт - 1.0, МпБ04 • 4Н20 - 0.002; Бе804 • 7Н20 - 0.002; 2пБ04 - 0.001, рН 7.0. В качестве единственного источника углерода использовали очищенные перегонкой декан (С10) или тридекан (С13), добавляемые в среду из расчета 50 мл/л питательной среды.
534
УЛЕЗЛО, РОГОЖИН
Таблица 1. Образование себациновой кислоты и рост дрожжей при культивировании ë. tropicalis на среде с деканом
Штамм C. tropicalis Себациновая кислота, мг/100 мл КЖ Количество клеток дрожжей, тыс./1 мл КЖ
47 1.1 200
97 0.75 200
2723 3.0 380
TB-8 4.2 400
Таблица 2. Влияние источников азота на образование себациновой кислоты при выращивании C. tropicalis Тв-8 на среде с деканом
Источник азота Концентрация источника азота, г/л Концентрация себациновой кислоты, мг/100 мл КЖ
NH4H2PO4 4.0 3.03
2.2 0.50
- 0.02
(NH4)2HPO4 4.0 8.00
2.0 0.97
1.0 0.07
(NH4)2SO4 1.2 0.75
0.6 0.51
0.3 0.10
После окончания культивирования дрожжей биомассу отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Супернатант использовали для приготовления образцов для газожидкостной хроматографии. Для этого рН супернатанта, доводили до 9.0-11.0 с помощью 2 н. KOH и в течение 20-30 мин экстрагировали диэтиловым эфиром неутилизированные алканы. Эфирный экстракт отбрасывали и с помощью 8 н. серной кислоты рН водной фазы доводили до 3.0 и трижды проводили экстракцию диэтиловым эфиром. Полученные экстракты высушивали над безводным сернокислым натрием, диэтиловый эфир упаривали и образец подвергали метилированию [14, 15].
Для приготовления стандарта 5 мг брассило-вой ("Sigma", США) или себациновой кислот ("Merck", Германия) растворяли в 4 мл 5%-ной HCl в обезвоженном метаноле и добавляли 0.5 мл обезвоженного бензола. Такой же процедуре подвергали и опытные образцы. Далее их помещали в колбу, соединенную с поглотителем, наполненным безводным хлористым кальцием. Колбу с образцом нагревали в силиконовой бане
в течение 2 ч при 80-100°С. После охлаждения до комнатной температуры в реакционную смесь добавляли два объема дистиллированной воды и трижды производили экстракцию 3 мл петролей-ного эфира. Экстракт нейтрализовали и сушили над карбонатом натрия и безводным сульфатом натрия. Полученный образец анализировали методом ГЖХ. Хроматографию проводили на хроматографе Хром 5 (Россия), снабженном пламенно-ионизационным детектором и интегратором С 1-100 (Чехия). Использовали стеклянную колонку диаметром 2.5 мм и длиной 2.5 м, жидкая фаза 8Б-30 5%, 15% на носителе Chromaton-N-AWDMCS (Чехия) с зернением 0.125-0.160 мм. Условия проведения анализа: газ-носитель - азот особой степени очистки - 40 мл/мин, воздух - 400 мл/мин, температура колонки - 190°С, детектора - 90°С, испарителя - 150°С. Пробу объемом 1 мкл вводили в испаритель хроматографа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были использованы виды дрожжей, относящиеся к различным родам: Candida, Sac-charomyces, Torulopsis, Debaryomyces, Hansenula, Pichia и Yarrowia. Всего было испытано около двухсот культур. Большинство испытанных культур дрожжей не были способны расти на декане или тридекане. Обнаружено несколько культур дрожжей, относящихся к Candida tropicalis, слабо утилизирующих тридекан и образующих небольшое количество брассиловой кислоты. Поэтому работа была продолжена по поиску продуцентов только себациновой кислоты. Большинство культур дрожжей при выращивании на средах, где единственным источником углерода был декан, также не обнаруживали роста. Штаммы дрожжей, которые обнаружили интенсивный рост относились к C. tropicalis. Культуры, обнаружившие рост и способность к образованию себациновой кислоты при культивировании на среде с деканом представлены в табл. 1. Наилучшей из испытанных культур дрожжей оказалась культура C. tropicalis Tb-8, образовывавшая наибольшее количество себациновой кислоты при культивировании на среде с деканом.
Источник азота в составе питательной среды при выращивании микроорганизмов-продуцентов ферментов имеет существенное значение и служит материалом для синтеза аминокислот, белков, нуклеиновых кислот. Для изучения влияния азотсодержащих соединений на синтез себациновой кислоты отобранной культурой C. tropicalis Tb-8 качестве источников азота в составе минеральной питательной среды были испытаны одно- и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый аммоний в трех концентрациях (табл. 2).
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ том 40 < 5 2004
ПОИСК ДРОЖЖЕЙ
535
сут
Рост культуры (103 кл./мл КЖ) при выращивании C. tropicalis на среде с деканом и друзамещенным фосфорнокислым аммонием.
Наилучшим источником азота для образования себациновой кислоты культурой C. tropicalis Tb-8 оказался двузамещенный фосфорнокислый аммоний в концентрации 4 г/л питательной среды. В процессе выращивания отобранной культуры C. tropicalis tb-8 на среде с деканом и двузаме-щенным фосфорнокислым аммонием проводили подсчет клеток в культуральной жидкости, результаты представлены на рисунке. Максимум накопления биомассы приходился на 4 сут.
Для получения производственной культуры, более активно синтезирующей дикарбоновые кислоты, необходимо привлечение генетических методов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Безбородое A.M. // Биотехнология продуктов микробного синтеза. М.: Агропромиздат, 1991.
C. 121-130.
2. Buhler M, Schindler J. // Biotechnology. Aliphatic hydrocarbons. Weincheim: Verlag Chemie, 1984. V. 6a. P. 329-385.
3. Finnerty W. // Microbial lipids. Microbial lipid metabolism / Ed. C. Ratledge, S. Wilkonson. London: Acad. Press, 1989. V. 2. P. 525-566
4. Schindler J., Meussdorffer F., Giesel-Buler H. // Forum Microbiol. 1990. V. 5. № 5. S. 174-181.
5. KesterA.S., Foster J.W. // J. Bacteriol. 1963. V. 85. № 4. P. 859-869.
6. Fukui S., Tanaka A. // Adv. Biochem. Eng. 1981. V. 19. № 1. P. 217-237.
7. Ratledge C. // Hydrocarbons in Biotechnology / Ed.
D. Harrison, I. Higgins, R. Watson. London: Heyden & Son, 1980. P. 133-153.
8. Rehm H, Reiff J. // Adv. Biochem. Eng. 1981. V. 19. № 1. P. 175-215.
9. Kato N., Kumada J., Tani Y, Ogata K. // Agr. Biol. Chem. 1971. V. 35. № 10. P. 1469-1475.
10. Fink G. // Meth. Enzymol. / Ed. H. Tabor., C.W. Tabor. New York, London: Acad. Press, 1970. V. 17a. P. 59-78
11. Uchio R., Shiio I. // Agr. Biol. Chem. (Tokyo) 1982. V. 36. № 6. P. 1389-1397.
12. UemuraN. // Ferment. Ind. 1985. V. 43. № 5. P. 436-444.
13. Kaneyuki H, Deno H., Heratsuka J., Mauyoshi T., Fu-rukawa T.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.