ЭКОЛОГИЯ, 2015, № 5, с. 397-400
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 574.2:599.4-161.9
ПОИСК GEOMYCES DESTRUCTANS - ОПАСНОГО ПАТОГЕНА РУКОКРЫЛЫХ (CHIROPTERA) В ПОДЗЕМЕЛЬЯХ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ © 2015 г. К. А. Кравченко*, А. С. Влащенко*, О. В. Прилуцкий**, А. С. Прилуцкая*
*Центр реабилитации рукокрылых Feldman Ecopark 62340 Украина, Харьковская область, пос. Лесное, Киевское шоссе, 12 **Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина 61022 Украина, Харьков, пл. Свободы, 4 e-mail: shusha.kravcheneo@gmail.com Поступила в редакцию 05.03.2014 г.
Ключевые слова: Geomyces destructans, грибы, пещеры, рукокрылые, Украина, Россия.
DOI: 10.7868/S0367059715050121
В 2006 г. в пещерах Северной Америки внезапно возникла пандемия неизвестной ранее грибной инфекции (Cohn, 2008; Blehert et al., 2009), которая поражала рукокрылых в состоянии зимней спячки (Gargas et al., 2009; Cryan et al., 2010). За период с 2006 г. по 2012 г. погибло 6 млн животных, 10 видов рукокрылых (http://www.batcon.org/index. php/what-we-do/white-nose-syndrome/subcategory), инфекция распространялась по несколько сотен километров в год от восточного побережья США в глубь материка (Turner, 2011; Raloff, 2011). Огромное число погибших животных и большая скорость распространения инфекции привлекли пристальное внимание исследователей к этой проблеме. В 2009 г. было установлено, что причиной гибели животных являлся ранее не известный науке вид грибов — Geomyces destructans Blehert et Gargas (Gargas et al., 2009), мицелий которого прорастает в покровных тканях рукокрылых, находящихся в состоянии гибернации (Carol et al., 2009). Заболевание получило название "синдром белого носа" (White Nose Syndrome — WNS) (Gargas et al., 2009).
Одна из основных гипотез возникновения внезапной пандемии — перенос гриба с территории Европейского континента (Wibbelt et al., 2010; Puechmaille et al., 2010). Данная гипотеза вскоре была подтверждена морфологическими, иммунологическими и генетическими исследованиями (Wernecke et al., 2012). В 2008-2011 гг. на территории Западной и Центральной Европы была проведена масштабная ревизия подземелий -мест зимовок рукокрылых, в целях обнаружения животных, пораженных синдромом белого носа (Wibbelt et al., 2010; Puechmaille et al., 2011). Самой восточной известной точкой нахождения гриба стали Гуменецкие штольни, расположенные на
территории Хмельницкой области, Украина (Puechmaille et al., 2011). Информация о распространении этого гриба в восточных и северных регионах Европы отсутствовала.
В задачи нашей работы входило: 1) выяснить распространенность G. destructans в подземных полостях Украины и Европейской России; 2) сравнить эффективность выявления G. destructans традиционными морфологическими и современными генетическими методами; 3) представить предварительные данные по микобиоте обследованных подземных полостей.
Пробы подземной микобиоты отбирали в 2010-2011 гг. из 7 подземелий антропогенного происхождения, которые являются крупными центрами зимовки рукокрылых и расположены в 4 районах Украины и европейской части России (табл. 1). Специальный учет зимующих рукокрылых проводили только в тех случаях, когда не было исчерпывающих литературных данных. Образцы подземной микобиоты отбирали методом улавливания спор на предметные стекла, покрытые с одной стороны тонким слоем агаризован-ной питательной среды (далее по тексту используется термин "споровые ловушки"), и на чашки Петри с агаризованной питательной средой (Flan-nigan, 1997). Для споровых ловушек и чашек Петри использовали питательные среды SAB (Sabouraud Peptone-Glucose Agar) и СМА (Cornmeal Agar) (Bills, Foster, 2004). Споровые ловушки закрепляли на стенках пещеры и экспонировали 60 дней. Чашки Петри экспонировали в пещерах от 1 до 3 ч. Оба способа отбора проб протестировали в июне-августе 2010 г. в штольнях "Липцы-1" и "Липцы-2". В других подземных полостях отбор проб проводили только посредствам экспонирования чашек Петри.
Таблица 1. Характеристики и локализация обследованных подземных полостей — мест зимовок рукокрылых
Местоположение подземной полости, координаты и название Тип подземной полости, горная порода Общая протяженность ходов, м Температура и влажность (в зимний период) Зимующие виды рукокрылых Источник
Украина, Харьковская обл., 50°12' с.ш., 36°22' в.д.: "Липцы-1" "Липцы-2" Штольня, песчаник 230 600 5-9°C; 90-100% M. daubentonii, M. dasycneme, Pl. auritus Влащенко, Наглов, 2006
Россия, Ленинградская обл., 59°40' с.ш., 30°47' в.д.: "Левобережная" "Пляжная" Штольня, белый кварцевый песок 5500 100 3-7°C; 85-100% M. daubentonii, M. dasycneme, M. nattereri, M. brandtii, E. nilssonii, Pl. auritus Стрелков, 1971; Чистяков, 2010
Украина, Хмельницкая обл., 48°45' с.ш., 26°37' в.д.: "Гуменецкие штольни" Штольня, известняк 29000 9-12°C; влажность не стабильна Rh. hipposideros, M. myotis, M. daubentonii, M. dasycneme, M. brandtii, B. barbastellus, Pl. auritus Тищенко, 2005; Godlevska et al., 2011
Украина, Запорожская обл., 47°26 ' с.ш., 35°6 ' в.д.: "Скелянские штольни" "Маячанская" Штольня, известняк; карстовая пещера, известняк 10000 27 11-12°C; 70-85% M. daubentonii, M. aurascens, Pl. austriacus Собственные данные
В штольнях "Липцы-1" и "Липцы-2" экспонировали по 10 чашек Петри (5 чашек со средой СМА и 5 — с SAB) и по 10 споровых ловушек (5 — со средой СМА и 5 — с SAB). В последующих сборах экспонировали чашки только со средой СМА, показавшей себя более эффективной. В подземельях Ленинградской области экспонировали 20 чашек Петри — 12 чашек в штольне "Левобережной" и 8 — в "Пляжной" соответственно; в штольнях Запорожской области: Скельки — 12 чашек и в пещере Маячанской — 3; в Гуменецких штольнях — 16 чашек. Помимо экспонирования чашек Петри, в Гуменецких штольнях проводили сбор соскобов непосредственно с эпителия животных, пораженных белым грибным налетом.
Чашки Петри с отобранными пробами культивировали в лабораторных условиях в холодильной камере при температурном режиме 4—10°С. Осмотр колоний грибов проводили каждые 4—5 дней для фиксирования ростовых и морфологических характеристик. Спороносящие образцы пересеивали в новые чашки Петри со средой СМА для выведения в чистые культуры, в некоторых случаях проводили 2—3 пересева методом укола (Билай, 1982).
Пробы соскобов грибного налета, взятого с рукокрылых, высевали в чашки Петри с СМА средой и культивировали в холодильной камере. Чистые культуры грибов подвергали визуальному осмотру с фиксацией цвета, текстуры, особенностей роста мицелия, наличия или отсутствия спо-роношения. Все образцы определяли до рода (в некоторых случаях — до уровня вида или таксона более высокого ранга, чем род) с использованием световой микроскопии (Билай, 1982). Образцы культур, морфологически сходных по описанию с G. destructans, были протестированы на присутствие молекулярного маркера рРНК гена внутреннего транскрибируемого спейсерного региона.
Генетическую идентификацию G. destructans проводили в лаборатории Лейбницкого института зоологии (Берлин, Германия) согласно опубликованным методикам (Peuchmaille et al., 2010; Wibbelt et al., 2010). Культуры из пещер "Левобережная", "Пляжная", штолен Скелек и Гуменецких, Маячанской балки были определены при помощи LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) метода (Niessen, \bgel, 2010) на базе Технического университета Мюнхена, Германия, благодаря любезной помощи доктора Людвига Неиссона.
ПОИСК GEOMYCES DESTRUCTANS — ОПАСНОГО ПАТОГЕНА РУКОКРЫЛЫХ 399
Таблица 2. Микромицеты, выделенные из обследованных подземных полостей — мест зимовок рукокрылых
Таксон Л1, Л2 Лб Пл Гш Сш М Способ идентификации
Acremonium sp. + — — — — — 1
Aspergillus spp. + + — — — — 1
Beauveria cf. bassiana + — — — — — 2
Cladosporium sp. + — — + — + 1, 3
Coelomycetes sp. — + — - — — 1
Eurotium sp. — — — + — — 3
Fusarium cf. sporotrichiella — — — + — — 3
Geomyces cf. pannorum — — — + — — 3
Geomyces sp. — + — — — — 3
Mortierella sp. — + — — — — 1
Nigrospora sp. — — — + + — 3
Oidiodendron sp. — — — — + — 3
Penicillium spp. + + — — + — 1, 3
Scopulariopsis sp. — — + — — — 3
Stachybotrys cf. chartarum — — — + — — 3
Примечание: Л1 -"Липцы-1", Л2 — "Липцы-2", Лб — "Левобережная", Пл —"Пляжная", Гш — "Гуменецкие штольни", Сш — "Скелянские штольни", М — карстовая пещера "Маячанская"; 1 — визуальная идентификация по основным морфологическим структурам, 2 — ПЦР-метод, 3 — LAMP-метод.
В результате исследования в чистых культурах удалось выделить представителей 13 родов, относящихся к 9 семействам, и одного представителя класса Coelomycetes Grove, которые в свою очередь относятся к типам Ascomycota Caval.-Sm., Basidiomycota Whittaker ex Moore и Zygomycota Moreau (табл. 2). Наиболее интересным нам кажется факт отсутствия таксонов грибов, очевидно доминирующих во всех или большинстве проб. Ни один из выделенных грибов не обнаружен в более чем половине исследованных подземелий, в том числе представители таких массовых во всех наземных экосистемах родов, как Penicillium Link, Aspergillus P. Micheli ex Haller и Cladosporium Link. Наиболее очевидное объяснение этому — постоянно низкие температуры в подземельях, способствующие формированию комплекса высокоадаптированных, стенобионтных видов и вытеснению видов-эврибионтов. По своим экологическим характеристикам большинство выделенных нами микромицетов являются сапротрофами, часть ен-томопаразитами. Представители этих родов (см. табл. 2), согласно K.J. Vanderwolf et al. (2013), довольно универсальны в составе микобиоты подземелий умеренных широт.
В наших исследованиях G. destructans не выявлен ни в одном из исследуемых подземелий, однако представители рода Geomyces были обнаружены в двух локалитетах — Гуменецкие штольни и пещера "Левобережная" (комплекс Саблинских штолен). В Гуменецких штольнях, где G. destruc-
tans ранее был подтвержден на покровах рукокрылых и зарегистрирован нами визуально (Peu-chmaille et al., 2011), в отобранных пробах не выявлен, однако идентифицирован G. pannorum — непатогенный представитель почвенной мико-биоты, который часто отмечали в подземельях, мес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.