ш
УДК 57.021
ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ NF-кВ И STAT1 СРЕДИ ПРОИЗВОДНЫХ (-)-ЦИТИЗИНА
© 2015 г. Ю. В. Вахитова#, *, Е. И. Фарафонтова*, Л. Ф. Зайнуллина*, В. А. Вахитов*, И. П. Цыпышева**, М. С. Юнусов**
*ФГБУНИнститут биохимии и генетики УНЦ РАН, 450054, Уфа, просп. Октября, 71 **ФГБУН Институт органической химии УНЦ РАН, Уфа Поступила в редакцию 02.12.2014 г. Принята к печати 16.12.2014 г.
Дизайн и синтез новых производных (-)-цитизина, имеющих широкий спектр фармакологической активности, представляет перспективный путь создания прототипов лекарств для терапии нейродеге-неративных расстройств, воспалительных заболеваний и средств лечения никотиновой зависимости. В данной работе проведен in vitro-скрининг библиотеки производных (—)-цитизина в отношении транскрипционных факторов NF-kB и STAT1 с использованием люциферазных репортерных конструкций. В настоящее время NF-kB, STAT1 и компоненты их сигнальных путей рассматриваются в качестве патогенетически значимых мишеней для разработки средств терапии инфекционных, онкологических, воспалительных, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. Библиотека представлена производными (-)-цитизина — аминами, амидами, тио- и карбоксамидами, замещенными по 3-, 5- и 12-положениям молекулы, а также некоторыми бимолекулярными производными. В результате скрининга среди производных (—)-цитизина выявлены соединения с умеренной (значения IC50 или EC50, находились преимущественно в миллимолярном диапазоне концентраций) ингибирующей и стимулирующей активностью в отношении NF-kB и STAT1. Установлено, что направленность действия определялась, главным образом, топологией заместителя, а выраженность эффекта — его природой (принципиальное значение имеет введение в молекулу ароматических и ада-мантильного заместителей, а также тионной или кетогруппы). При оценке эффекта исследуемых соединений на ДНК-связывающую активность NF-кBиSTAT1, стимулированную специфическими индукторами (TNFa и IFNy соответственно), выявлены группы веществ, различающихся по характеру их влияния на данные биомишени: соединения, подавляющие базальную и стимулированную активность NF-kB и STAT 1; соединения, способствующие увеличению базальной, но вызывающие снижение стимулированной активности NF-kB, и соединения, эффект которых связан с увеличением базальной и индуцируемой активности NF-kB и STAT1. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что одним из возможных механизмов биологического действия производных (-)-цитизина является их способность оказывать влияние на компоненты NF-kB- и STA^-зави-симых сигнальных путей.
Ключевые слова: (-)-цитизин, люциферазные репортерные конструкции, NF-kB, STAT1, структура-активность, механизмы действия.
DOI: 10.7868/S0132342315030100
ВВЕДЕНИЕ
(—)-Цитизин ((1Д)-1,2,3,4,5,6-гексагидро-1,5-метано-8#-пиридо[1,2-а][1,5]диазоцин-8-он) — представитель группы трициклических хинолизи-диновых алкалоидов, содержащийся в надземной части растений семейства бобовых (БаЪаееае), основными источниками которого являются пред-
Сокращения: Ad — адамантил, All — аллил; IFNy —интерферон у; TNFa — фактор некроза опухоли a; IL-8 — интер-лейкин 8; COX-2 — циклооксигеназа 2; нАХР — никотиновый ацетилхолиновый рецептор; ТФ — транскрипционный фактор.
# Автор для связи (тел.: +7(347) 235-60-88; факс: +7 (347) 235-60-88; эл. почта: juvv73@gmail.com).
ставители родов Thermopsis и Chamaecytisus [1—5]. Как для самого алкалоида, так и для ряда его 12-Ы-, 3- и 5-замещенных производных установлены спазмолитические, анальгетические, нейротропные, гипогликемические, противовоспалительные, противовирусные, антигипертензивные, антиаритмические свойства [6—12]. Биологическую активность проявляют также соединения, содержащие заместители непосредственно в диазабициклонона-новой части молекулы [10].
Фармакологические исследования, проведенные как с использованием гетерологичных систем, экспрессирующих различные подтипы хо-
линорецепторов, так и на мембранных препаратах различных структур головного мозга грызунов показали, что (—)-цитизин является частичным агонистом никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) а4р2, полным агонистом центральных а7-нАХР и ганглионарных а3р4-нАХР [6, 9, 11, 13]. Кроме того, показано сродство производных (-)-цитизина также и к рецепторам адреналина (а1-адренорецепторы), дофамина ^2), серотонина (5НТ3), гистамина (Н3), каината, му-скарина (М1 и М2), глутамата (ионотропный рецептор NMDA (М-метил^-аспартат) подтипа) и холецистокинина [8].
К настоящему времени в многочисленных исследованиях установлены закономерности влияния природы и положения заместителей у производных (-)-цитизина на их аффинность в отношении того или иного подтипа никотиновых ацетилхолиновых рецепторов [8, 9, 12, 14]. (—)-Цитизин и его аналоги, вследствие высокого сродства к нАХР и схожему с никотином фармакологическому профилю, рассматриваются в качестве весьма перспективных средств для лечения никотиновой зависимости [15, 16]. Отметим, что именно никотиноподобное действие стало предпосылкой к применению (—)-цитизина в медицинской практике в качестве дыхательного ана-лептика ("Цититон") и средства для облегчения отвыкания от курения (пленки и таблетки "Та-бекс"). Несмотря на достаточно интенсивные исследования, акцент в изучении механизмов действия (-)-цитизина и его производных в основном делается на анализе селективности и аффинности к различным подтипам нАХР. В то же время, полагают, что гипогликемические и противовоспалительные свойства (-)-цитизина и некоторых его производных не связаны с центральными никотиновыми рецепторами. Как и большинство природных соединений, (-)-цити-зин реализует свое биологическое действие через различные мишени.
Как уже отмечалось выше, (-)-цитизин является привлекательной исходной молекулой для синтеза веществ с потенциальной нейротропной активностью — лекарственных кандидатов для фармакотерапии заболеваний, связанных с когнитивным дефицитом. В то же время, имеется несколько работ, в которых показана противовоспалительная активность никотина, (-)-цитизина и его бифункционального производного, обусловленная, как полагают, их действием преимущественно в отношении а7-подтипа нАХР [17—19]. По мнению авторов, данное свойство может быть весьма полезно с точки зрения разработки препаратов для лечения таких воспалительных заболеваний, как рассеянный склероз, боковой амиотрофи-ческий склероз, язвенный колит, ревматоидный
артрит и другие, в патогенезе которых значимая роль отводится нарушениям иммунных функций.
Транскрипционный фактор (ТФ) NF-kB (nuclear factor kappa of activated B cells) играет ключевую роль в регуляции экспрессии множества генов, вовлеченных в пролиферацию, дифферен-цировку, ангиогенез и апоптоз клеток, а также генов воспалительного, иммунного ответа и канцерогенеза [20]. Транскрипционный фактор STAT1 (signal transducers and activators of transcription) опосредует передачу сигналов от рецепторов факторов роста и цитокинов, в частности интерферонов, регулируя тем самым активность генов, участвующих в процессах пролиферации, апоптоза, воспаления, иммунитета, канцерогенеза и метастазирования [21]. В настоящее время данные ТФ рассматриваются в качестве патогенетически значимых мишеней для разработки средств терапии инфекционных, онкологических, воспалительных, аутоиммунных, и нейродегенеративных заболеваний [22—24]. Имеются сведения о сопряженности а7-подтипа нАХР с сигнальными каскадами, регулирующими активность факторов NF-kB и STAT1 [25, 26].
В данной работе нами проведен скрининг библиотеки производных (-)-цитизина с целью поиска потенциальных модуляторов транскрипционных факторов NF-kB и STAT1. На первом этапе исследований были идентифицированы соединения, активирующие/ингибирующие базальную активность указанных ТФ. Далее, отобранные в предварительном раунде скрининга вещества были протестированы на предмет их способности модулировать активность NF-kB и STAT1, стимулированную специфическими индукторами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе проведен in vitro-сравнитель-ный анализ влияния веществ (1)—(22) на ДНК-связывающую активность ТФ NF-kB и STAT1 с использованием люциферазных репортерных конструкций. Производные (2)—(22) (-)-цитизи-на (1), получены введением амино-, амидо-, тио-и карбоксамидных групп в 3-, 5- или 12-положе-ние исходной молекулы, включая ^-замещенные аналоги. Библиотека соединений представлена вторичными и третичными аминами ((1)—(3), (14), (15)), одним амидом (4), тио- ((9)-(13), (17)) и карбоксамидами ((7), (8), (16), (18)—(20)) обозначенной выше топологии, а также бимолекулярными производными (21), (22). В предварительных экспериментах была проведена оценка их потенциальных цитотоксических свойств (МТТ-тест). Как оказалось, ни одно из указанных соединений не проявило цитотоксической активности в отношении условно-нормальной клеточной линии НЕК293 (значения IC50 > 1 мМ; данные не приведены).
R1 = Н, R2 = Н, R = Н (1), R1 = Н, R2 = Н, R = Ме (2), R1 = Н, R2 = Н, R = Вп (3), R1 = Н, R2 = Н, R = Bz (4), R1 = Н, R2 = Н, R = (СО)КН2 (5), R1 = Н, R2 = Н, R = (СО)КНЛИ (6), R1 = Н, R2 = Н, R = (CO)NHPh (7), R1 = Н, R2 = Н, R = (CO)NHЛd (8), R1 = Н, R2 = Н, R = (CS)NH2 (9), R1 = Н, R2 = Н, R = (CS)NHЛll (10),
R1 = Н, R2 = Н, R = (CS)NHPh (11), R1 = Н, R2 = Н, R = (CS)NHЛd (12), R1 = Н, R2 = Н, R = (CS)NH(CO)Ph (13), R1 = ОТ2, R2 = Н, R = Ме (14), R1 = ОТВп, R2 = Н, R = Ме (15), R1 = ОТ^О^НЛД, R2 = Н, R = Ме (16), R1 = ОТ^^НЛИ, R2 = Н, R = Ме (17), R1 = ОТ^О^НР^ R2 = Н, R = Ме (18), R1 = Н, R2 = NH(CO)NHЛll, R = Ме (19), R1 = Н, R2 = NH(CO)NHPh, R = Ме (20),
R = -(ОДб- (21)
R = кА^ (22)
Н Н
Рис. 1. Библиотека производных (-)-цитизина (1).
Как следует из полученных данных, лишь некоторые вещества, входящие в состав представленной библиотеки (рис. 1), проявили активность в отношении исследуемых ТФ. В целом, воздействие соединений на базальную активность МБ-кВ- и ЗТЛП-зависимых сигнальных путей выражена незначительно, о чем судили по значениям ГС50 и EC50, находящимся преимущественно в милли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.