научная статья по теме ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИЮ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИЮ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 71-77

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 616.092

ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МОЗГЕ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ, ПЕРЕНЕСШИХ ПРЕНАТАЛЬНУЮ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИЮ © 2015 г. А. В. Пустыгина*, Ю. П. Милютина, И. В. Залозняя, А. В. Арутюнян

Федеральное государственное бюджетное учреждение "НИИакушерства и гинекологии им. Д.О. Отта"

Северо-Западного отделения РАМН

Проведено исследование влияния гипергомоцистеинемии (ГГЦ), вызванной у крыс при беременности метиониновой нагрузкой, на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидант-ной защиты (АОЗ) в мозге новорожденных крысят. При ГГЦ материнского организма возникает дисфункция эндотелия, играющая важную роль при развитии акушерских патологий, связанных с нарушением маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотоков. Экспериментальную ГГЦ вызывали ежедневным пероральным введением метионина (в концентрации 0.6 мг/кг массы животного) самкам крыс в течение всей беременности. В мозге и сыворотке крови новорожденных крысят определяли показатели окислительного стресса (ОС) и АОЗ. У новорожденных животных, матери которых в течение всей беременности получали метионин, уровень содержания гомоцисте-ина (ГЦ) в первый день жизни был выше, чем в контроле, и они имели достоверно сниженную по сравнению с контрольной группой массу тела. В мозге исследуемых крысят были обнаружены повышенные уровни продуктов окислительной модификации белков и ДНК, и отмечалось снижение общей антиокислительной активности (ОАА) и активности супероксиддисмутазы (СОД). В сыворотке крови животных, перенесших пренатальную ГГЦ, активность супероксиддисмутазы была также снижена по сравнению с контрольной группой. Результаты проведенных исследований согласуются с представлениями о том, что повышенное содержание ГЦ во время беременности приводит к развитию ОС, увеличению риска возникновений структурных и функциональных нарушений центральной нервной системы плода, следствием чего может быть снижение когнитивных функций у потомства.

Ключевые слова: пренатальная гипергомоцистеинемия, окислительный стресс.

DOI: 10.7868/S1027813315010070

В настоящее время накопилось множество данных экспериментальных и клинических исследований, которыми установлено, что повышенное содержание гомоцистеина в организме (гипергомоцистеинемия) вносит значительный вклад в развитие нейродегенеративных процессов и нарушение когнитивной функции у животных и человека [1—5]. Несмотря на то, что молекулярные механизмы нейротоксичности гомоцистеина во многом остаются не раскрытыми, получены неоспоримые доказательства того, что одним из существенных факторов токсического действия гомоцистеина на ЦНС является окислительный стресс. Спонтанное окисление ГЦ в гомоцистеиновую кислоту [6] так же, как и его аутоокисление в гомоцистин и другие дисульфиды, сопровождается образованием активных форм кислорода (АФК) [7—9]. Кроме того, ги-

* Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3; тел. 328-98-05; e-mail: apustygina@rambler.ru.

пергомоцистеинемия стимулирует пероксидацию липидов и угнетает антиоксидантную систему в нервной ткани [10—12].

Известно, что мозг обладает наибольшей чувствительностью к повреждающему действию АФК, что связано с исключительно высокой потребностью в насыщении кислородом, значительным содержанием железа и полиненасыщенных жирных кислот с разветвленной боковой цепью, а также относительно слабой, по сравнению с другими органами, системой антиоксидантной защиты [4, 13]. Одним из интенсивно развиваемых в последние десятилетия представлений об обусловленной окислительным стрессом нейро-токсичности ГЦ является гипотеза о его способности вследствие структурного сходства с глута-матом взаимодействовать с ММЭА-рецепторами глутаминовой кислоты, что приводит к нарушению его нейромедиаторной функции [4, 14—16].

Установлено, что ГГЦ является причиной многих акушерских патологий, приводя к разви-

тию осложнений беременности, в основе которых лежат нарушения маточно-плацентарного и пло-дово-плацентарного кровотоков, происходящие в результате тромбозов сосудов, васкулитов, инфарктов плаценты, что может вызвать такие патологические состояния, как самопроизвольные выкидыши в первом и втором триместрах беременности, внутриутробная задержка развития плода, внутриутробная гибель плода, отслойка плаценты, гестоз, плацентарная недостаточность, пороки развития [17—21]. Одним из существенных факторов, вызывающих указанные осложнения беременности, при которых в крови матери обнаруживается высокое содержание ГЦ, является окислительный стресс. Продукты окислительного повреждения липидов, белков и нуклеиновых кислот могут накапливаться в материнском организме и опосредствовать токсические эффекты ГГЦ. Однако вопрос о роли окислительного стресса в токсическом действии пренатальной ГГЦ на потомство, особенно на развивающийся мозг плода, остается открытым. Лишь недавно появились единичные работы, свидетельствующие об актуальности этой проблемы [1, 22]. В связи с этим представлялось важным определить степень окислительных повреждений макромолекул, особенно белков и ДНК, в нервной ткани у потомства, пренатальное развитие которого протекало в условиях ГГЦ.

Целью настоящего исследования было изучение влияния экспериментальной пренатальной ГГЦ на показатели про- и антиоксидантной системы в мозге крысят при рождении.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании были использованы половозрелые самки крыс линии ^з1аг (37 особей), которые содержались в виварии в условиях контролируемого светового режима (день 6.00—18.00 ч, ночь 18.00—6.00 ч). Животные были разделены на 2 группы. В контрольную группу (п = 16) вошли самки, которые после оплодотворения до родов находились на обычном пищевом режиме. Во вторую — подопытную группу (п = 21) — включили самок, в тот же период подвергшихся дополнительному ежедневному принудительному перо-ральному введению метионина [23]. После предварительного определения стадий эстрального цикла по влагалищным мазкам, к самкам, находящимся в стадии проэструса, подсаживали самцов. На второй день после оплодотворения в дневное время начинали вводить метионин в концентрации 0.6 мг/кг массы животного или воду.

Новорожденных крысят декапитировали, выделяли мозг и сыворотку крови, которые хранились при —80°С для дальнейшего исследования. Перед тестированием предварительно размороженный мозг гомогенизировали в фосфатном бу-

фере (0.01 М, рН 7.4). В гомогенатах мозга определяли количество белка методом Лоури [24].

Для подтверждения развития экспериментальной ГГЦ в сыворотке крови определяли содержание гомоцистеина иммуноферментным методом с использованитем тест-системы Axis-Sheld (Великобритания).

Содержание 8-гидрокси-2'-деоксигуанозина в гомогенатах головного мозга определяли имму-ноферментным методом с использованием тест-системы DNA Damage (8-hydroxy-2'-deoxygua-nosine) Enzo Life Sciences (США). Для оценки количества продуктов окисления белков (Advanced oxidation protein products) использовали тест-систему АОРР Immunodiagnostik (Германия). Для иммуноферментного определения концентрации нитротирозина использовали тест-систему Nitro-tyrosine — Hycult Biotech (Нидерланды). Аскорбиновую кислоту (АК) определяли с помощью тест-системы Vitamin C — Immunodiagnostik (Германия). В сыворотке витамин С находится в двух формах — в виде собственно аскорбиновой кислоты или в окисленной форме, в виде дегидроаскор-бата. Обе формы биологически активны. Используемый в нашем исследовании колориметрический метод позволяет определять суммарную концентрацию обеих форм. Для определения активности супероксиддисмутазы использовали иммуноферментный набор Superoxide Dismutase фирмы Cayman Chemical Company (США). Данная тест-система позволяет с помощью соли тет-разолия определять радикалы, образуемые при участии ксантиноксидазы и гипоксантина. Тест-система Antioxidant фирмы Cayman Chemical Company (США) позволяет оценить общую анти-оксидантную активность, включая активность всех ее компонентов (витаминов, белков, липи-дов, тиолов и глутатиона, мочевой кислоты и др.). Метод основан на способности антиоксидантов, присутствующих в образце, ингибировать окисление ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]) при участии метмиоглобина.

Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета программ STATISTICA 7.0. Для определения достоверности различий в исследуемых группах применяли непараметрический ^-критерий Манна—Уитни и ^-критерий Крускала—Уоллиса. Данные представляли, как медианы [25—75 перцентили]. Различия считались достоверными прир < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как показано на рис. 1а, у новорожденных животных, матери которых в течение всей беременности получали метионин, уровень содержания ГЦ в сыворотке крови в первый день жизни был достоверно выше, чем у крысят контрольной

40 35 30 25 20 15 10 5 0

7.7 15.1 т 3.8

Контроль

31.1

9.6 6.3

Метионин

а

сса 5 а

6.44 16.21 5.88

Контроль

I

5.04

4.35 4.14

Метионин

Рис. 1. Концентрация общего гомоцистеина в сыворотке крови (мкмоль/л) (а) и масса тела (г) (б) новорожденных крысят после перенесенной пренатальной ГГЦ.

(*р < 0.001 — отличие группы с метиониновой нагрузкой от контрольной группы).

а

7

*

6

*

группы - 9.6 [6.3-31.1] и 5.1 [3.8-7.7] мкМ, соответственно.

Новорожденные крысята, матери которых в течение беременности получали метионин, имели достоверно сниженную по сравнению с контрольной группой массу тела (рис. 1б).

Приведенные в таблице данные показывают достоверное повышение в гомогенатах мозга новорожденных крысят 8-гидрокси-2'-дезоксигуа-нозина, являющегося маркером окислительной модификации ДНК: 15.2 [13.6-16.0] нг/мг белка — в первой группе и 18.5 [16.5-20.4] нг/мг белка -во второй группе.

Установлено также, что у животных, прена-тальное развитие которых происходило в условиях повышенного содержания ГЦ, в 1-й день жизни наблюдалось усиленное образование продуктов окислительной модификации белков в головном мозге -41.0 [37.1-41.4] мкмоль/мг белка, в контрольной группе - 31.9 [30.1-32.9] м

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком