БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.986-992
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 576.32.03:582.24
РОЛЬ ФОСФОИНОЗИТИД-З-КИНАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ ФОРМЫ И НАПРАВЛЕННОГО ДВИЖЕНИЯ ПЛАЗМОДИЯ Physarum polycephalum
© 2008 г. Н.Б. Матвеева, С.И. Бейлина, В.А. Теплов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области
E-mail: beylina@iteb.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
На плазмодии Physarum рв1усерка1ит - многоядерной амебоидной клетке с автоколебательным характером движения - исследовано действие специфических ингибиторов фосфоинозитид-3-киназы вортманнина и LY294002 на форму клетки, двигательное поведение и хемотаксис к глюкозе. Показано, что оба ингибитора вызывают редукцию фронтальной зоны плазмодия и уменьшение эффективности переноса массы при миграции, а также подавляют хемотаксис к глюкозе и устраняют характерные изменения режима автоколебаний в ответ на обработку глюкозой всей поверхности клетки. Выраженность этих эффектов зависит от концентрации ингибитора, времени воздействия и размера плазмодия. Участие фосфоинозитид-3-киназы в формировании фронтальной зоны и хемотаксисе плазмодия Physarum свидетельствует в пользу универсального характера связи полярной формы и направленного движения амебоидных клеток с распределением фосфоинозитидов в плазматической мембране.
Ключевые слова: амебоидное движение, автоколебания, хемотаксис, фосфоинозитид—3-киназа, фосфатидилинозит-3-фосфатаза, фосфолипаза C, плазмодий Physarum polycephalum.
Важность выяснения механизмов, лежащих в основе направленного движения клеток, связана с его определяющей ролью в морфогенезе, иммунном ответе, заживлении ран и метаста-зировании опухолей. Все вовлеченные в эти процессы клетки обладают амебоидным типом подвижности: они имеют динамично организованную актомиозиновую сократительную систему, способны к миграции в самоподдерживающейся полярной форме и таксисам в градиентах внешних стимулов. Для свободножи-вущих амебоидных клеток способность к направленному двигательному ответу на аттрак-танты и репелленты является основой их выживания.
Работы последних лет свидетельствуют, что у нейтрофилов и амеб Dictyostelium важнейшим посредником в создании полярной формы и организации направленного движения является фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат (Р1Р3) -продукт фосфорилирования фосфатидилино-зит-4,5-бисфосфата (Р1Р2) фосфоинозитид-3-ки-
Сокращения: PIP3 - фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат; PIP2 - фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат; PI3K - фосфо-инозитид-3-киназа класса I, PTEN - фосфатидилинозит-3-фосфатаза и гомолог тензина, PLC - фосфолипаза С; PH-домены - домены, гомологичные обнаруженным в плекстрине; GFP - зеленый флуоресцирующий белок.
назой класса I (Р13К). Обратный процесс осуществляет фосфатидилинозит-3-фосфатаза (фос-фатаза и гомолог тензина, РТБК) [1]. Интерес к этой ветви обмена фосфоинозитидов резко возрос после появления сведений о накоплении Р1Р3 в области мембраны, обращенной в сторону источника хемотактического сигнала [2-6]. Распределение Р1Р3 было выявлено с помощью конструкций зеленого флуоресцирующего белка (ОБР) с белками, содержащими Р^-селектив-ные РН-домены. Для определения локализации рецепторов и изменений в связывании Р13К и РТБК с мембраной также были использованы соответствующие конструкции с ОБР. Показано, что в амебах Dictyostelium при гомогенном распределении цАМФ-рецепторов и сопряженных с ними тримерных О-белковых комплексов вдоль тела клетки накопление Р1Р3 в области мембраны, обращенной к источнику цАМФ, связано с двумя противоположно направленными процессами. Один из них - быстрая (5 с) активация Р13К и ее перемещение из цитоплазмы в мембрану, другой - удаление из этой области РТБК, исходно равномерно распределенной в мембране [6], где она связана с Р1Р2
[7].
Настоящая работа является первым исследованием, посвященным выяснению роли регу-ляторного пути Р13К - РТБК в контроле дви-
гательного поведения плазмодия РЪуэагит ро-1усерка1ит. Эта гигантская многоядерная клетка, образующаяся в результате разобщения ядерного и клеточного делений, совмещает черты, характерные для амеб и тканевых клеток. Двигательная программа плазмодия близка к двигательной программе фибробластов [8]. Первой ее фазой является изотропное распластывание с формированием лидирующего края по всей периферии клетки, второй - миграция в поляризованной форме с периодическим чередованием перемещения фронта и подтягивания «хвоста» [9]. В отличие от фибробластов, где такие изменения формы связаны с активностью ламеллы, в плазмодии они относятся к протоплазме в целом.
Мигрирующий плазмодий выглядит как веерообразная протоплазматическая пленка, сплошная у фронта и трансформирующаяся в древовидную сеть отдельных протоплазматиче-ских тяжей в более каудальных областях. Такую форму плазмодий поддерживает в градиенте внешних стимулов, а также при пространственно однородном их распределении и в отсутствие внешнего сигнала. Как и в других амебоидных клетках, протоплазма плазмодия дифференцирована на относительно стационарную гелеоб-разную эктоплазму и золеобразную эндоплазму, текущую по тяжам и пронизывающим эктоплазму каналам. Структуру эктоплазмы определяют глубокие инвагинации плазматической мембраны [10], которая образует единый комплекс с актомиозиновым цитоскелетом плазмодия. Компонентами цитоскелета являются прикрепленный к мембране сплошной слой параллельно лежащих актиновых филаментов - кор-текс и система радиальных и продольных ци-топлазматических фибрилл, которые крепятся к мембране в зоне инвагинаций и поддерживают структуру эктоплазмы [10]. Сокращение эктоплазмы осуществляется благодаря взаимодействию олигомеров миозина с прикрепленными к мембране актиновыми филаментами [11]. Направление и скорость потока эндоплазмы, так же как величина силы, генерируемой эктоплазмой, меняются в автоколебательном режиме с периодом, варьирующим в зависимости от функционального состояния плазмодия от 1 до 5 мин [12]. Распластывание, миграцию и таксисы плазмодия определяет результирующий перенос эндоплазмы в сторону лидирующего края.
Плазмодий является уникальной моделью для исследования биофизических механизмов амебоидного движения. Размеры клетки, а также то, что целостность плазматической мембраны и двигательная активность быстро вос-
станавливаются после перерезки плазмодия, позволяет изолировать плазмодиальные тяжи и использовать разработанную для мышц технику для определения их механических характеристик. Автоколебательный режим двигательной активности, показанный как на свободноживу-щих амебах [13], так и на тканевых клетках [8,13,14], на плазмодии ярко выражен и легко регистрируется. Для исследований действия внешних стимулов важны уникальные возможности получения из одного плазмодия стандартных по размеру и форме образцов, а также приложения стимула к любой части клетки.
В исследованиях роли Р1Рз в хемотаксисе и при свободной миграции на Dictyostelium и ряде тканевых клеток основное внимание уделялось направленной полимеризации актина [15] в лишенных гранулярной протоплазмы частях клетки - ламеллах и на верхушках псевдоподий. Использование в настоящей работе в качестве объекта исследования плазмодия РИу-sarum позволило показать, что активность Р13К может контролировать также общую форму и подвижность клетки, практически полностью состоящей из гранулярной протоплазмы. На примере хемотаксиса к глюкозе, ранее не исследовавшего ся ни на одном типе клеток, показано, что способность к распознаванию ее пространственного градиента и изменение режима автоколебаний в ответ на стимуляцию всей поверхности клетки также контролируются активностью Р13К.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование плазмодия. Микроплазмодии Ркуэагит ро1усерка1ит, штамм ВКМ(Б) 3283 выращивали в поверхностной культуре по модифицированному методу [16] на подложке из 2% агарового геля с подкормкой овсяными хлопьями.
Хемотактичеекие тесты. Временной ход хе-мотактической реакции оценивали морфологически и по изменению режима автоколебаний сократительной активности. Автоколебания регистрировали оптическим методом [17], как локальные колебания толщины и пульсирующие перемещения края плазмодия. Экспериментальную камеру освещали снизу физиологически неактивным красным светом [18] и помещали так, чтобы изображение выбранного участка клетки проецировалось на отверстие в маске, установленной в фокальной плоскости бинокулярной лупы. Установка позволяла одновременно с регистрацией интенсивности света, проходящего через выделенный маской участок, визуально оценивать состояние объекта. Для
(aj щщ
родлв
Ш^ШМ ILJ1
шш
щ
(ójMMH КчСл* ,<"
ЕЯ»
ИрдД
№
Рис. 1. Распластывание плазмодия, полученного из капель протоплазмы, формирующихся при проколах плазмодиальных тяжей, в контроле (а) и на подложках, содержащих 50 мкМ ЬУ294002 (б) и 1 мкМ вортманнина (в). Масштабный отрезок - 250 мк.
измерений использовали миниатюрные плазмодии, мигрировавшие по полупрозрачной папиросной бумаге, помещенной на подложку из 1,5 % агара с введенным ингибитором Р13К. Для регистрации временного хемотактического ответа плазмодий вместе с бумажной подложкой переносили в экспериментальную камеру на 1-миллиметровый слой 1,5 % агара, содержавшего, помимо используемого ингибитора, 1 мМ глюкозы.
Для оценки хемотаксиса в ступенчатом градиенте глюкозы в контроле и под действием
ингибиторов PI3K плазмодий помещали на границу раздела между двумя агаровыми подложками, одна из которых содержала аттрактант. Ингибитор вводили в обе подложки, а образец плазмодия подвергали предварительной инкубации с этим ингибитором. В качестве образцов использовали круглые фрагменты фронтальной пленки. Для их получения плазмодию позволяли мигрировать поверх вырезанных с помощью стального пробойника кружков фильтровальной бумаги диаметром 3 мм, которые предварительно раскладывали вблизи фронтальной зоны. Затем их изолировали, подрезая гладкую фронтальную пленку с помощью пробойника, и подвергали инкубации с ингибитором. Хемотаксис оценивали по доле фронтов, ориентированных в сторону аттракт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.