БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.967-971
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.352.4
РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПАЛЬМИТАТ/Са2+-АКТИВИРУЕМОЙ ПОРЫ В ПАЛЬМИТАТ-ИНДУЦИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ
© 2008 г. К.Н. Белоелудцев*, Н.В. Белоелудцева*, Г.Д. Миронова* **
* Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул.
Институтская, 3; E-mail: bekonik@rambler.ru ** Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области, пр. Науки, 3
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Приведены результаты исследования возможной роли митохондриальной циклоспорин А-не-чувствительной пальмитат/Са -активируемой поры в пальмитат-индуцированном апоптозе. Установлено, что открытие пальмитат/Са -активируемой поры приводит к высокоамплитудному набуханию органелл и выходу проапоптотического белка - апоптоз-индуцирующего фактора. При этом наблюдается лишь кратковременное незначительное снижение мембранного потенциа^+а, который восстанавливается в течение 1 мин. Обсуждается возможная роль пальмитат/Са -активируемой поры в запуске пальмитат-индуцированного апоптоза.
Ключевые слова: митохондрии, пальмитат/Са2+-активируемая пора, апоптоз, мембранный потенциал.
Как известно, пальмитиновая кислота (ПК) является природным индуктором апоптоза [1,2]. Развитие апоптоза, вызываемого этой жирной кислотой, происходит как по каспаз-зависимо-му, так и каспаспаз-независимому пути [3] и наблюдается в различных типах клеток: кар-диомиоцитах [1,2,4], гематопоэтических клетках [5], панкреатических Р-клетках [6] и др. [3,7,8]. В то же время механизм индукции апоптоза пальмитиновой кислотой остается неясным. Однако многие исследователи сходятся на том, что митохондрии играют центральную роль в этом процессе [1-9].
Недавно было показано, что пальмитиновая кислота вызывает открытие во внутренней мембране митохондрий циклоспорин А (ЦсА)-не-чувствительной Са2+-зависимой поры [10-12]. Установлено, что эта пора отличается от митохондриальной ЦсА-чувствительной поры (МРТ-поры) как по своим свойствам, так и по механизму образования [11-15]. Так ПК/Са2+-активируемая пора нечувствительна к известным модуляторам МРТ-поры и способна самопроизвольно закрываться [10-12]. После открытия ПК/Са2+-активируемой поры митохон-дриальный мембранный потенциал в зависимости от используемых концентраций пальмитиновой кислоты и Са2+ либо полностью восста-
Сокращения: ПК - пальмитиновая кислота, ЦсА - циклоспорин А, АИФ - апоптоз-индуцирующий фактор, ТФФ - тетрафенилфосфоний.
навливался со временем, либо снижался лишь до определенного уровня. Однако в присутствии некоторых модуляторов (цитохрома с или рутениевого красного) потенциал восстанавливался практически до исходного значения [14,16]. В то же время МРТ-пора в митохондриях печени и сердца этим свойством не обладает, и при ее открытии мембранный потенциал не восстанавливается [17]. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что в основе механизма образования поры лежит способность пальмитиновой кислоты связывать Са2+ со сродством, которое на один-два порядка выше, чем сродство к этому иону других жирных кислот и липидов [18]. В экспериментах на липосомах было показано, что образование поры происходит по механизму хе-мотропного фазового перехода, когда при связывании Са2+ с пальмитиновой кислотой в ли-пидной мембране происходит сегрегация жирной кислоты в отдельные мембранные домены
[15].
Недавно в нашей лаборатории была обнаружена прямая корреляция между способностью различных жирных кислот активировать апоптоз в культуре клеток и вызывать образование Са2+-зависимой ЦсА-нечувствительной поры в митохондриях [16]. Так, пальмитиновая кислота оказывает как проапоптотическое, так и порообразующее действие в присутствии Са2+. В то же время производные пальмитата (2-бро-мопальмитиновая кислота, пальмитоил-СоА), а также и ненасыщенные жирные кислоты не
Рис. 1. Открытие ЦеА-нечувствительной пальми-тат/Са2+-активируемой поры приводит к набуханию митохондрий (а) и выходу АИФ (б). Среда инкубации содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 5 мМ янтарной кислоты, 6,5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенона, 10 мМ HEPES-KOH, рН 7,4. Добавки: пальмитиновая кислота (ПК) (30 нмоль/мг белка), Са2+ (70 нмоль/мг белка), среда инкубации была дополнена 1 мкМ ЦсА.
способны как вызывать образование Са2+-за-висимой поры в митохондриях [11,12,19], так и индуцировать апоптоз [2,5,7]. Было предположено, что в основе механизма пальмитат-ин-дуцированного апоптоза лежит образование во внутренней мембране митохондрий Са2+-зави-симой поры. Установлено также, что открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры приводит к выходу из митохондрий цитохрома с [16], что предполагает развитие апоптоза по каспаз-зависимому пути.
В настоящей работе мы продолжили изучение возможного участия пальмитат/Са2+-ак-тивируемой поры в запуске апоптоза. Была исследована возможность высвобождения при открытии поры апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ). Известно, что этот белок вызывает развитие апоптоза по каспаз-независимому пути [20]. Показано, что в присутствии неорганического фосфата в среде инкубации открытие пальмитат/Са2+-активируемой поры приводит к высокоамплитудному набуханию органелл и выходу АИФ. Мембранный потенциал при этом полностью восстанавливается.
цию митохондриального белка определяли методом Лоури.
Набухание митохондрий регистрировали по изменению поглощения суспензии митохондрий (А) при длине волны 540 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 25°С на спектрометрической оптоволоконной оптической системе «Осеап Ор1;1сз USB 2000» (Осеап Ор^сэ, 1пс, США). Среда инкубации содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 5 мМ янтарной кислоты, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенона, 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,4). Концентрация митохондриального белка в кювете составляла 0,4 мг/мл.
Мембранный потенциал оценивали по перераспределению тетрафенилфосфония (ТФФ+) через внутреннюю митохондриальную мембрану. В этом случае среда инкубации была дополнена 1 мкМ ТФФ+. Концентрацию ТФФ+ измеряли ТФФ+-чувствительным электродом.
Для оценки выхода из митохондрий АИФ органеллы инкубировали в концентрации 1 мг/мл в различных экспериментальных условиях. После этого митохондрии осаждали в течение 20 мин при 13000 g. Отбирали 15 мкл супернатанта. Фракционирование белков проводили с помощью электрофореза в полиакрил-амидном геле (12% гель) в присутствии додецил-сульфата натрия при 40 мА с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 ч при 80 В. Мембрану блокировали в течение ночи 2% обезжиренным молоком в фосфатно-солевом буфере при комнатной температуре и инкубировали затем в течение 1 ч с антителами к АИФ (1:2000). В дальнейшем мембрану отмывали и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с перок-сидазой хрена (1:1000). После промывания АИФ выявляли окрашиванием, происходящим в результате пероксидазной реакции с диаминобен-зидином в присутствии 0,02% перекиси водорода.
В работе использовали сахарозу, пальмитиновую кислоту, янтарную кислоту, АДФ, ЭГТА, ЭДТА, ЦсА, ротенон, HEPES, трис, KH2PO4, NaH2PO4, антитела к АИФ (Sigma, США), ман-нитол, СаС12 (Мегск, Германия).
МАТЕPИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии выделяли из печени половозрелых белых крыс массой 220 - 250 г общепринятым методом дифференциального центрифугирования [12]. Среда выделения содержала 210 мМ маннитола, 70 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES-KOH fcH 7,4). Полученная суспензия митохондрий содержала 90 мг митохондриального белка на 1 мл. Концентра-
PЕЗУЛЬТАТЫ
В настоящей работе проводили изучение возможного участия пальмитат/Са2+-активируе-мой поры в запуске апоптоза. Была исследована возможность высвобождения АИФ при открытии поры.
Как показано на рис. 1, открытие поры, индуцированное пальмитиновой кислотой (30 нмоль/мг белка) и Са2+ (70 нмоль/мг белка), приводит к высокоамплитудному набуханию
РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПАЛЬМИТАТ
969
Рис. 2. Набухание митохондрий, индуцированное открытием ЦсА-нечувтствительной пальмитат/Са2+-активируемой поры (а) и МРТ-поры (б). Среда инкубации такая же, как на рис. 1, и дополнена 1 мМ КН2РО4. Добавки: (а) - пальмитиновая кислота (ПК) (30 нмоль/мг белка), Са2+ (70 нмоль/мг белка), среда инкубации была дополнена 1 мкМ ЦсА; (б) - Са2+ (200 нмоль/мг белка).
митохондрий и выходу из органелл проапоп-тотического белка АИФ.
На рис. 2 видно, что в присутствии в среде инкубации неорганического фосфата пальмитиновая кислота и Са2+ также вызывают ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий. При этом скорость набухания и амплитуда практически не изменяются. Это набухание также сопровождается ЦсА-нечувствительным выходом АИФ из органелл (рис. 3). Следует отметить, что количество АИФ, вышедшего из митохондрий при открытии ЦсА-нечувствительной ПК/Са2+-активируемой поры, меньше по сравнению с количеством белка, вышедшего при
Рис. 3. Выход АИФ из митохондрий, индуцированный открытием пальмитат/Са2+ -активируемой и МРТ-порами. МХ - митохондрии (без добавок); контроль - супернатант контрольных (без добавок) митохондрий; ПК/Са2+ - супернатант митохондрий после добавления 30 нмоль ПК и 70 нмоль/мг белка Са2+; Са2+/Фн - супернатант митохондрий печени мыши после добавления 200 нмоль/мг белка Са2+. Среда инкубации такая же, как на рис. 2, и
дополнена циклоспорином А (обозначено знаком «+»).
Рие. 4. Изменения мембранного потенциала, индуцированные открытием ПК/Са2+-активируемой (а) и MPT (б) порами. Среда инкубации, как на рис. 2. Добавки: (а) - ПК (30 нмоль/мг белка), Са2+ (70 нмоль/мг белка), среда инкубации была дополнена 1 мкМ ЦсА; (б) - Са2+ (200 нмоль/мг белка).
открытии МРТ-поры, индуцированной Са2+ (200 нмоль/мг белка) в присутствии 1 мМ неорганического фосфата (Фн) (рис. 2б и 3).
Как было показано ранее, индукция поры ПК (30 нмоль/мг белка) и Са2+ (70 нмоль/мг белка) в отсутствие Фн приводит к стойкой и продолжительной деполяризации митохондрий. При этом падение потенциала было не полным (на митохондриальной мембране сохранялся потенциал около 30 - 70 мВ), а рутениевый красный, лантан и ЭГТА восстанавливали его практически до исходного уровня
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.