»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 7995, том 21, № 4, с. 261 - 267
УДК 577.112.34.083.3
ПОЛИАКРОЛЕИНОВЬШ ЛАТЕКС В КАЧЕСТВЕ ТВЕРДОФАЗНОГО НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММУНОРАДИОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА. СРАВНЕНИЕ С МИКРОКРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ И ПОВЕРХНОСТЬЮ ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ ПРОБИРОК
© 1995 г. О. В. Жоров, В. А. Прейгерзон, Ю. В. Лукин*, В. П. Зубов*, С. П. Марцев*
Институт биоорганической химии АНБ, 220141, Минск, Жодинская ул., 512; * Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16!!О Поступила в редакцию 31.05.94 г.
Иммуносорбент, полученный ковалентной иммобилизацией антител на полиакролеиновом латексе, исследован в сравнении с сорбентами на основе микрокристаллической целлюлозы и поверхностью полистирольных пробирок в двухцентровом иммунорадиометрическом анализе ферритина. Показано, что полиакролеиновьш латекс обеспечивает ковалентное связывание до 75 мг белка на 1 г сухого полимера с эффективностью иммобилизации 50 - 70% и высокой эффективной константой ассоциации иммобилизованных антител (А'., = 4.5 х 109 М"'). Соответствующие характеристики для сорбента на основе микрокристаллической целлюлозы составляли 33 мг/г, 25 - 33% и 4.3 х 108 М-1. В иммунорадиометрическом анализе ферритина иммуносорбенты на основе полиакролеинового латекса и целлюлозы обеспечивают близкую по величине аналитическую чувствительность на уровне (0.7 - 0.9) х 10"13 М ферритина и демонстрируют возможность устранения "хук-эффекта". По сравнению с иммуносорбентом на основе полистирольных пробирок преимущества полиакролеинового латекса заключаются в снижении минимальной определяемой концентрации (повышении аналитической чувствительности), в расширении динамического диапазона анализа и отсутствии "хук-эффекта".
Ключевые слова: иммуноанализ, полиакролеиновьш латекс, иммуносорбенты, ферритин.
Иммобилизованные антитела являются одним из основных реагентов иммуноанализа. В качестве носителей для иммобилизации наиболее часто применяются либо пластиковые поверхности пробирок, шариков или лунок, либо мелкодисперсные суспензии микрочастиц различных полимеров [1, 2]. Основным преимуществом пластиковых поверхностей является простота адсорбционной иммобилизации я операционной схемы анализа, исключающей необходимость стадии центрифугирования. Недостаток таких твердофазных иммунореагентов - низкая емкость, ограниченная количеством антител в монослое и малой поверхностью линейных полимеров [3 - 5], а также невозможность проведения реакции в наиболее эффективном двухстадийном режиме с первоначальным взаимодействием антитела и антигена в растворе и последующим связыванием образовавших комплексов с иммуносорбентом [1]. Несмотря на то что использование мелкодисперс-
Сокращения: 'МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза,
ПАЛ - полиакролеиновый латекс. # Автор для переписки.
ных иммуносорбентов операционно усложняет анализ за счет необходимости центрифугирования, такие сорбенты обеспечивают высокие концентрации антител, вносимых в реакцию. Известно, что увеличение количества иммобилизованных антител улучшает ряд основных параметров иммуноанализа: сокращается время реакции, уменьшается величина минимальной определяемой концентрации антигена (С'гтп), повышается раз," ""Тающая способность анализа и величина максимального связывания меченых антител [6-8].
Следует особо отметить, что высокоемкие носители иммобилизованных антител необходимы для устранения такого негативного явления иммунометрического анализа, как "хук-эффект" [6, 8, 9], т.е. эффект парадоксального снижения фракции связанных с иммуносорбентом меченых антител при увеличении концентрации антигена выше некоторой критической. "Хук-эффект" характерен для всех двухцентровых иммуномет-рических систем в определенном диапазоне концентраций и приводит к тому, что в результате наличия восходящего и нисходящего сегментов
В, мг/г
в/т,%
В, мг/г
в/т,%
Т, мг/г
Рис. 1. Количественные характеристики иммобилизации белка антисыворотки на ПАЛ (а) и МКЦ (б): 1 - зависимость количества иммобилизованного белка (В) от внесенного в реакцию белка (Т); 2 - выход реакции иммобилизации.
кривой "доза-эффект" одному значению сигнала связанных: с иммуносорбентом меченых антител могут соответствовать две различные концентрации определяемого антигена, одна из которых является ложной.
В связи с перечисленными выше особенностями иммуноанализа получение высокоемких мелкодисперсных носителей для иммобилизации им-мунореагентов (антигенов и антител) остается одной из актуальных задач в данной области исследований. Такие носители должны соответствовать одновременно нескольким критериям, в том числе обладать достаточной гидрофильнос-тью, высокой концентрацией центров связывания иммунореагентов и простотой процедуры иммобилизации. Микросферы полиакролеинового латекса, впервые использованные в качестве твердой фазы в иммуноанализе в 1982 - 1985 гг. [10 - 12], до настоящего времени в достаточной степени не изучены как аналитический реагент. Ранее в одной из наших лабораторий разработан метод получения микросфер монодисперсного полиакролеинового латекса (ПАЛ), позволяющий получать легкодиспергируемые полимерные носители, различающиеся плотностью реакционных альдегидных групп, размером частиц и цветом реагентов [13, 14]. Концентрация поверхностных альдегидных групп на микросферах ПАЛ варьирует в пределах 1.5 - 4.5 ммоль/г в зависимости от диаметра (обычно с1 0.1 - 1.5 мкм). Важно отметить, что ПАЛ не требует предварительной активации для иммобилизации белка. Эти твердофазные носители представляются перспективными для использования в тестах с визуальной детекцией латексной агглютинации, а также в количественном иммуноанализе.
Ферритин является металлопротеином с функцией хранения и запасания железа, которое в сво-
бодном виде токсично для организма. Ферритин имеет молекулярную массу около 450 кДа и состоит из 24 субъединиц двух типов - Н и Ь [ 15, 16] Уровень ферритина в сыворотке зависит от концентрации железа в организме [16, 17]. Отличительной особенностью клинического иммуноанализа ферритина является потребность опреде ления белка в сыворотке крови в широком концентрационном диапазоне, от 2 нг/мл (кон центрация ферритина в сыворотке при анемии) до 20 мкг/мл и более (при гемохроматозах различной этиологии) [18, 19]. Это приводит к необходимости использования иммуносорбентов с высокой антигенсвязывающей способностью для устранения "хук-эффекта" и обеспечения высокой аналитической чувствительности.
В данной работе исследован ПАЛ как твердофазный суспензионный носитель для иммобилизации антител и их последующего использования в иммунорадиометрическом анализе ферритина в сравнении с двумя широко распространенными носителями - микрокристаллической целлюлозой (МКЦ) и поверхностью полистирольных пробирок.
Нами использовано несколько критериев для оценки иммуносорбентов на основе ПАЛ и МКЦ: 1) емкость полимера по белку и эффективность (выход) иммобилизации; 2) значение максимального и неспецифического связывания меченых антител и отношение сигнал/шум; 3) наклон кривой "доза-эффект" и минимальная определяемая концентрация антигена; 4) степень проявления "хук-эффекта".
Возможность получения высокоемких иммуносорбентов на основе ПАЛ показана на рис. 1а, отражающем результаты иммобилизации на латексе иммунной сыворотки кроликов, содержащей антитела к ферритину из селезенки человека.
в/т,%
в/т,%
Рнс. 2. Зависимость связывания ферритина в твердофазной иммунорадиометрической системе от емкости иммуносорбента. В/Т - отношение связанных ( 1]антител к их общему количеству в растворе. В пробирки вносили: а - 2 мг ПАЛ с общим содержанием иммобилизованного белка антисыворотки 75 (1), 45 (2) и 18 мг (3) на 1 г, б - 10 мг МКЦ с общим содержанием иммобилизованного белка 32 (/) и 18 мг (2) на 1 г.
Рис. 3. Зависимость эффективности связывания ферритина в двухцентровом иммунорадиометрическом анализе от количества вносимого иммуносорбента. а - ПАЛ: 2 (/), 1 (2), 0.5 мг (3); б - МКЦ: 40 (1), 10 (2), 1 мг (5). Емкость иммуносорбентов: 57 мг/г ПАЛ и 32 мг/г МКЦ. Обозначение оси ординат - как на рис. 2.
Результат свидетельствует о высокой емкости полученного иммуносорбента (до 75 мг иммобилизованного белка на 1 г носителя) и высокой эффективности иммобилизации (выход иммобилизованного белка 50 - 70%). Для сравнения были получены иммуносорбенты на основе МКЦ (рис. 16) и показано, что количество связанного с целлюлозой белка в 2 раза ниже при тех же экспериментальных условиях. Кроме того, выход иммобилизованного белка для целлюлозы примерно в 2 раза ниже аналогичного показателя для ПАЛ.
Важным преимуществом ПАЛ является тот факт, что при иммобилизации на нем антител их
инактивация происходит в меньшей степени, чем для МКЦ, что подтверждается данными определения эффективных констант ассоциации (таблица). Примерно на порядок большая аффинность антител, иммобилизованных на ПАЛ, наряду с повышенной емкостью носителя обеспечивает латексному иммуносорбенту дополнительные преимущества (рис. 1), которые были затем подтверждены в дальнейших исследованиях (рис. 2 - 4).
Исследование зависимости основных параметров иммуноанализа от концентрации иммобилизованных антител для ПАЛ и МКЦ (рис. 2) показывает заметный положительный эффект
Рис. 4. Определение количества иммуносорбента, необходимого для эффективного связывания иммунных комплексов ферритина с [ 1251]антнтелами. Определяли специфическое связывание иммунных комплексов при концентрации ферритина 17.5 нг/мл (кривые 1, 3,5) и неспецифическое связывание (1251|антител в отсутствие ферритина (кривые 2, 4, 6). Емкость иммуносор-бентов: 75 мг/г ПАЛ (7,2), 16 мг/г ПАЛ (3,4), 32 мг/г МКЦ (5, 6). Син - концентрация суспензии иммуносорбента. Обозначение оси ординат - как на рис. 2.
высокой емкости ПАЛ и сохранения параметров аффинности иммобилизованных на твердой фазе антител. Увеличение количества твердофазных антител приводит к сдвигу зоны "хук-эффекта" в область высоких концентраций антигена, что расширяет динамический диапазон анализа. Одновременно с этим возрастает величин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.