УДК 577.112.7+547.458
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЛАКТОФЕРРИНА И pН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ИХ ОСНОВЕ
© 2014 г. Н. Г. Балабушевич*, Н. В. Борзенкова*, В. А. Изумрудов*, Н. И. Ларионова*, О. А. Безбородова**, Е. Р. Немцова**, Р. И. Якубовская**
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
Химический факультет, Москва 119991 **Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Минздрава России, Москва 125284 e-mail: nbalab2008@gmail.com Поступила в редакцию 18.06.2013 г.
Приготовлены и исследованы суспензии нерастворимых полиэлектролитных комплексов декс-трансульфата (ДС) различной молекулярной массы с лактоферрином (ЛФ). Изучена эффективность включения ЛФ и ДС в комплекс при рН 3.0 и 4.0, определены размеры и Z-потенциал частиц. Комплексы, сформированные при рН 3.0, отличались более высокой стабильностью. Взаимодействие с ДС приводило к двукратному снижению антиоксидантной активности ЛФ, хотя по данным ИК-спектроскопии комплексообразование не сопровождалось конформационными изменениями молекул ЛФ. Микрокапсулирование осуществляли обработкой суспензий отрицательно заряженных комплексов ЛФ-ДС растворами протамина или хитозана различной молекулярной массы. Определение состава, размера и Z-потенциала продуктов взаимодействия позволило подобрать условия приготовления рН-зависимых полиэлектролитных микрочастиц с максимальным включением ЛФ, которые способны постепенно высвобождать гликопротеин в условиях, моделирующих прохождение желудочно-кишечного тракта человека. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разрабатываемого подхода для формирования рН-чувствительных биополиэлектро-литных микрочастиц, пригодных для доставки ЛФ к клеткам-мишеням при пероральном введении.
DOI: 10.7868/S0555109914020044
Лактоферрин (ЛФ) представляет собой желе-зосвязывающий гликопротеин семейства транс-ферринов. Он уникален многообразием физиологических функций в различных органах и тканях [1—3]. Присутствуя в высокой концентрации в различных секретах (слезах, слюне, бронхиальном секрете, соке поджелудочной железы, сперме и др.), во вторичных гранулах эритроцитов и сыворотке крови, ЛФ защищает организм от бактерий, вирусов и простейших. ЛФ обладает высокой антиоксидантной активностью и оказывает имму-номодулирующее действие, стимулируя пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов, усиливая продукцию противовоспалительных цитоки-нов и подавляя образование провоспалительных цитокинов. В последние годы активно изучаются ЛФ из женского молока и рекомбинантный ЛФ человека [2].
ЛФ содержит ~700 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу около 80 кДа [4]. Полипептидная цепь образует две глобулярные М- и С- доли с размерами 55 х 35 х 35 А, каждая из которых содержит железосвязывающий домен [5]. Углеводный компонент состоит из полисахаридов М-ацетиллактозаминного типа, а-1,6-фу-козилированных по остатку М-ацетилглюкозами-
на, который соединен с полипептидной цепью. ЛФ может существовать в железо-ненасыщенной и железо-насыщенной формах. Каждая молекула способна обратимо связывать два иона Бе3+, координированных четырьмя белковыми лиганда-
ми и двумя НСО--анионами [6]. Изоэлектриче-ская точка ЛФ по разным данным составляет от 8.0-8.5 до 10.5-11.0 [2, 7-9].
Постоянный рост числа инфекций, устойчивых к действию традиционных лекарственных препаратов, привлекает особое внимание к ЛФ, обладающему антимикробными и иммуномоду-лирующими свойствами [10]. Наличие в организме человека рецепторов ЛФ делает возможным его использование в качестве вектора для направленной доставки лекарственных и диагностических средств [10-13].
Особую роль гликопротеин играет в желудочно-кишечном тракте человека. Попадая в желудок при пероральном введении, молекула ЛФ распадается на физиологически активные М- и С-доли, которые подавляют развитие патогенной микрофлоры и стимулируют рост бифидо- и лак-тобактерий, тем самым способствуя нормализации деятельности кишечника при различных па-
тологических состояниях [1]. Однако для достижения максимального терапевтического действия необходимо обеспечить полноценное взаимодействие ЛФ с рецепторами энтероцитов в кишечнике, что возможно только при полной защите гли-копротеина от протеолиза в желудке и тонком кишечнике. Для решения этой задачи ЛФ включают в таблетки, покрытые растворимой в кишечнике оболочкой [14], или связывают в комплексы с различными микро- и наноносителями [10]. К настоящему моменту получены и изучены комплексы гликопротеина с полисахаридами разного строения (пектином [15], производными хитоза-на-сукционил-, сульфат-, триметил- и др., араби-ногалактаном, декстраном [16] и казеином [17]). Описаны липосомы [18, 19], в том числе пегелиро-ванные [20], а также лактоферриновые микро- и на-ночастицы на основе хитозана [21, 22], альгинатно-хитозановых смесей [23, 24], фосфата кальция, покрытого хитозаном и альгинатом [25].
Одним из перспективных подходов решения указанной проблемы является микрокапсулирова-ние белков путем послойной адсорбции разноименно заряженных полиэлектролитов на белковых микроагрегатах [26]. Микрочастицы получают простым смешением компонентов в мягких условиях, что особенно ценно при использовании лабильных белков. Продемонстрированы рН-чув-ствительные свойства полиэлектролитных микрочастиц для ряда белков с различными физико-химическими и биологическими свойствами (про-теолитические ферменты, белковые ингибиторы протеаз и гормоны) и пролонгированное высвобождение белков из микрочастиц [27—31]. Микрочастицы защищают капсулированные белки от протеолиза [32, 33]. В качестве полиэлектролитов могут быть использованы полисахариды — биосовместимые и биодеградирумые декстрансульфат (ДС), в каждом звене которого содержится 1—3 сульфатные группы, хитозан (Хит), с рКа аминогрупп ~6.5 [29—33]. Среди белков в качестве поликатиона хорошо зарекомендовал себя низкомолекулярный и сильноосновный белок протамин (Прот5) с М„ — 5 кДа и р1 10.5, содержащий 70% остатков аргинина [28]. Отметим, что в литературе отсутствуют сведения о микрокапсулировании гликопротеинов указанным методом и с помощью перечисленных полиэлектролитов.
По мере продвижения по желудочно-кишечному тракту значения рН значительно изменяются: 1.0—2.0 в желудке, 7.2—8.0 в тонкой кишке и 8.5—9.0 в толстой кишке [34], поэтому перспективно создание полиэлектролитного комплекса ЛФ, обеспечивающего дозированное рН-зависи-мое высвобождение гликопротеина в заданных условиях.
Цель работы — получение и исследование нерастворимых полиэлектролитных комплексов
ЛФ с ДС, а также их взаимодействия с хитозаном и протамином для создания микрочастиц, обеспечивающих рН-зависимое пролонгированное высвобождение гликопротеина.
МЕТОДИКА
Материалы. ЛФ женского молока получен в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена. Использовали образцы ДС со средней молекулярной массой 5, 100, 500 кДа (ДС5, ДС100, ДС500), Хит со средней молекулярной массой 150 и 400 кДа (Хит150, Хит^) и степенью дезацетилирования соответственно 87% и 85% ("Fluka", Швейцария). Образец Хит 22кДа (Хит22) со степенью дезацетилирования 98% любезно предоставлен проф. Варламовым В.П. ("Российское хитиновое общество"). Протамином служил коммерческий препарат, выделенный из спермы лосося ("Sigma", США).
Получение микрочастиц. Комплексы ЛФ-ДС формировали смешением 0.5 мл растворов ЛФ (20 мг/мл) и полианиона (5 мг/мл) в 0.15 М NaCl при рН 3.0—8.0. Образующиеся суспензии интенсивно перемешивали 20 мин, центрифугировали 2 мин при 200—700 g и осадок дважды отмывали в растворе без полиэлектролита с теми же значениями ионной силы и рН путем ресуспендирования и центрифугирования.
Полученные таким образом суспензии стабилизировали добавлением 1.0 мл раствора Хит или протамина (2.5 мг/мл) в том же растворителе, перемешивали 10 мин и центрифугировали 2 мин при 200 g. Осадок дважды ресуспендировали таким же образом и центрифугировали. Для хранения микрочастицы суспендировали в растворе с той же ионной силой и рН или дважды промывали слабокислым раствором HCl, рН 4.0, а затем лиофильно высушивали.
Характеристика микрочастиц. Размер микрочастиц в суспензии определяли оптически с помощью микроскопа Opton III "Carl Zeiss" (Германия). Масштабную линейку перемещали в вертикальном направлении и фиксировали размер 100 частиц, попадающих в область перемещения. Результаты обрабатывали статистическими методами.
Морфологию микрочастиц изучали сканирующей электронной микроскопией с ускоряющим напряжением 3—5 кВ при увеличении 5000— 150000 на аналитическом комплексе MIRA LMU компании "Tescan" (Чехия). Предварительно суспензию микрочастиц обрабатывали ультразвуком на ультразвуковой бане "Eltrosonic Type 07" (Германия) в течение 15 мин, затем 5 мкл суспензии помещали на предметное стекло, высушивали и наносили тонкий (<5 нм) токопроводящий углеродный слой. Измерение Z-потенциала микроча-
стиц проводили на установке "Zetasizer Nano ZS" фирмы "Malvern Instrument" (Великобритания) в 0.01 М KCl при рН 4.0.
Содержание ЛФ определяли методом Лоури [35]. При анализе препаратов, содержащих ЛФ и протамин, концентрацию гликопротеина оценивали по D280, а концентрацию протамина — по методу Лоури с учетом вклада гликопротеина. ДС анализировали по методу Дюбуа [36], учитывая наличие углеводов в гликопротеине. Хит определяли по методике, изложенной в [37]. Состав микрочастиц анализировали после их разрушения в щелочных средах, рН 12.0. Эффективность включения ЛФ и ДС определяли по отношению содержания каждого компонента в микрочастицах к препарату, взятому для их получения.
Образцы для ИК-спектроскопии готовили растиранием 1 мг препарата и 150 мг KBr, прессовали в таблетки и снимали спектры на приборе "Spectrum One" фирмы "Perkin-Elmer" (США).
Анализ высвобождения ЛФ. Суспензию микрочастиц ЛФ разбавляли в 20—40 раз универсальным буфером (0.02 М H3PO4, 0.02 M CH3COOH, 0.02 M H3BO3 + 0.1 M NaOH, pH 2-10) до концентрации гликопротеина 0.20-0.25 мг/мл, перемешивали 1 ч при 100 об/мин, центрифугировали 5 мин при 800 g и определяли концентрац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.