научная статья по теме ПОЛИМОРФИЗМ A1267G ГЕНА HSPA1B ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОЛИМОРФИЗМ A1267G ГЕНА HSPA1B ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 728-732

ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 575

ПОЛИМОРФИЗМ A1267G ГЕНА HSPA1B ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ#

© 2014 г. M. J. Ghorbani1, Z. Salehi2*, E. E. Sabet2, F. Ejtehadi3

department of Biology, International Pardis, University of Guilan, Rasht, Iran 2Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran 3Internal Medicine Department, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran Поступила в редакцию 26.02.2014 г.

Принята к печати 25.03.2014 г.

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (Peptic Ulcer Disease, PUD) — распространенное заболевание, поражающее значительное число людей во всем мире, и на его возникновение могут влиять условия окружающей среды и генетические факторы. Белки теплового шока (Heat Shock Proteins, HSP) главным образом функционируют как молекулярные шапероны и индуцируются во время стрессовых воздействий. Как показано, замена A на G в позиции 1267 гена HSPA1B коррелирует с уровнем экспрессии мРНК HSPA. В данной работе оценивали взаимосвязь между полиморфизмом A1267G в гене HSPA1B и риском заболевания PUD в популяции жителей Ирана. В исследовании принимали участие 100 субъектов, прошедших гастроскопию. Образцы ДНК, экстрагированные из биоптатов, гено-типировали, используя ПЦР с оценкой полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP). В результате гастроскопии PUD диагностировано у 50 пациентов, среди которых распределение генотипов AA, AB и BB соответствовало 10, 88 и 2%. У других 50 пациентов (без PUD), составивших контрольную группу, распределение по генотипам AA/AB/BB составляло 40/52/8%. Значимая ассоциация выявлена между генотипом HSPA1B и PUD (6.76 OR; 95% CI, 2.26-20.2; p = 0.0006). Таким образом, полиморфизм A1267G гена HSPA1B может быть маркером чувствительности к PUD.

Ключевые слова: язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, HSPA1B, полиморфизм.

ANALYSIS OF HSPA1B A1267G GENE POLYMORPHISM IN PEPTIC ULCER, by M. J. Ghorbani1, Z. Salehi2*, E. E. Sabet2, F. Ejtehadi3 ^Department of Biology, International Pardis, University of Guilan, Rasht, Iran, *E-mail: geneticzs@yahoo.co.uk; 2Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran; 3Internal Medicine Department, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran). Peptic ulcer disease is a common illness, affecting a considerable number of people worldwide, and its occurrence can be influenced by environmental and genetic factors. Heat shock proteins (HSPs) function mostly as molecular chaperones, and are induced by various stresses. The A to G transition at position 1267 of the HSPA1B gene was shown to correlate with changes in the level of HSPA mRNA expression. Here, the relation between A1267G polymorphism of the HSPA1B gene and risk of peptic ulcer in the Iranian population was evaluated. One hundred subjects, who underwent gastroscopy, took part in the study. DNA samples extracted from the biopsy tissues were genotyped using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). After gastroscopy, peptic ulcer was diagnosed for 50 patients; among them the distribution of AA/AB/BB genotypes was 10, 88 and 2%, respectively. As for the other 50 subjects (without peptic ulcer) included in the control group, the AA/AB/BB genotypes were identified as 40, 52 and 8%, respectively. A significant association was found between the HSPA1B genotype and peptic ulcer (6.76 OR; 95% CI, 2.26-20.2; p = 0.0006). Thus, the HSPA1B A1267G polymorphism may be a marker of susceptibility to peptic ulcer.

Keywords: peptic ulcer diseases, HSPA1B, polymorphism. DOI: 10.7868/S0026898414050048

Принятые сокращения: HSP (heat shock proteins) — белки теплового шока; NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drugs) — нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты; PUD (peptic ulcer disease) — язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; PCR-RFLP (polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism) — ПЦР с оценкой полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

# Текст статьи представлен на английском языке.

* Эл. почта: geneticzs@yahoo.co.uk

ПОЛИМОРФИЗМ A1267G ГЕНА HSPA1B ПРИ ЯЗВЕННОЙ БОЛЕЗНИ ЖЕЛУДКА

729

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (PUD) — многофакторное заболевание, поражающее значительную часть населения Земли. Болезнь развивается, когда на люминаль-ной поверхности эпителиальных клеток есть дисбаланс между "агрессивными" факторами, такими как Helicobacter pylori, соляная кислота, пепсины, нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (NSAID), желчные кислоты, ишемия, гипоксия, курение, алкоголь, и "протективны-ми" факторами: бикарбонат, слой слизи, кровоснабжение слизистой, простагландины и факторы роста [1]. Пептическая язва считается главной причиной случаев неварикозного кровотечения в желудочно-кишечном тракте и более чем в 65% случаев кровавой рвоты и/или мелены [2, 3].

Белки теплового шока (HSP), функционирующие главным образом как молекулярные шаперо-ны, участвуют в фолдинге и сборке вновь синтезированных белков клетки, обеспечивают белковый транспорт во внутриклеточные компартменты и задействованы в рефолдинге неправильно свернутых белков [4]. Семейство 70 кДа белков теплового шока (Hsp70, или HSPA) — одно из самых консервативных. У человека 13 различных генов кодируют белки HSPA: HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L, HSPA2, HSPA4, HSPA4L, HSPA5, HSPA6, HSPA7, HSPA8, HSPA9, HSPA12A и HSPA14 [5]. Показано, что гены HSPA1A и HSPA1B кодируют идентичный продукт, который представляет собой главный индуцируемый стрессом белок семейства HSPA [6]. Кодирующие области HSPA1A и HSPA1B обладают высокой гомологией, различаясь только шестью единичными заменами оснований, в то же время замечены некоторые различия в последовательностях их промоторных и З'-нетранслируемых областей. Экспрессия HSPA может индуцироваться различными стрессовыми воздействиями, такими как высокая температура, этанол, ионы мышьяка, инфекции, тяжелые металлы, кислородное голодание, ядохимикаты и интермедиаты активных форм кислорода, и это может противодействовать токсичным эффектам цитокинов [7] и защищать клетки от токсичных эффектов при повышенном содержании оксидов азота (NO) [8].

Ранее показано, что экспрессия HSPA в муко-цитах (the gastric mucosa of the stomach) желудка ослабляется при инфекции Helicobacter pylori (H. pylori) [9] и в присутствии ацетилсалициловой кислоты [10]. Из этого следует, что генетические факторы хозяйской клетки, типа полиморфизмов HSP могут играть важную роль в защите слизистой желудка от повреждений, индуцируемых H. pylori и ацетилсалициловой кислотой. Ген HSPA1B имеет PstI-сайт расщепления благодаря транзиции A на G в позиции 1267 (rs1061581), а различные генотипы по HSPA1B, образующиеся в результате этой замены, как показано, ассоциированы с различными

уровнями мРНК HSPA [11—13]. В этом исследовании на клинических образцах (биоптаты слизистой желудка) мы оценили взаимосвязь между риском язвенной болезни и полиморфизмом в позиции 1267 кодирующей области гена HSPAlB.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клинические образцы. В исследовании принимали участие 100 пациентов, посещавшие Центр эндоскопии больницы Хафеза и Шахида Фагехи (the Endoscopy Center of Hafez and Shahid Faghehi Hospital) в течение 2012 года. Это исследование одобрено Экспертным советом организации. Все участники прошли гастроскопическое исследование, в результате чего им либо поставили диагноз "язвенная болезнь", либо выявили нормальное состояние желудка. У каждого пациента учитывали статус использования нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), возраст, пол и инфекцию H. pylori. Пациенты с тяжелыми системными заболеваниями или инфекцией H. pylori, а также со злокачественными заболеваниями без язвы были исключены из исследования.

Экстракция ДНК и генотипирование. Геномную ДНК выделяли из высушенных образцов ткани желудка, используя Rapid Genomic DNA Isolation Kit ("Investigating Unit MBST", Иран). Праймеры: (прямой) 5'-CATCGACTTCTACACGTCCA-3' и (обратный) 5'-CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3' -использовали для амплификации фрагмента, содержащего сайт 1267 A/G гена HSPAlB. Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 30 нг геномной ДНК, ПЦР-бу-фер, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 мкМ каждого праймера и 1.5 ед. ДНК-полимеразы super Taq ("Gen Fanavaran", Иран).

ПЦР проводили по следующему протоколу: начальная денатурация при 95 0C в течение 5 мин, 34 цикла: денатурация 40 с при 950C, отжиг 40 с при 5PC, элонгация 60 с при 720C — и заключительная элонгация В мин при 720C. После этого ПЦР-продукты расщепляли 10 ед. PstI ("MBI Fermentas", США) в суммарном объеме 20 мкл при 370C в течение 3 ч. Продукты расщепления разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле и окрашивали бромидом этидия. После расщепления ДНК, не содержащая PstI-сайт в составе HSPAlB-гена, дает один продукт размером 1117 п.н. (аллель А), тогда как содержащая PstI-сайт дает фрагменты размером 936 и 1В1 п.н. (аллель B). Эти результаты подтверждены повторным генотипи-рованием более 10% образцов.

Статистический анализ. Большинство анализов проведено с использованием Medcalc (Version 12.1.4.0). Ферментативный анализ проведен с использованием программного обеспечения

730

GHORBANI и др.

1 2 3 4 5 6 7

1500

Паттерны PstI-фрагментов HSPA1B. Маркеры молекулярной массы ДНК показаны на дорожке 1. На дорожках 2 и 3 представлены образцы с генотипом HSPA1B (1267) AA дикого типа; на дорожках 4 и 5 — образцы гетерозиготного (1267) AB генотипа; а на дорожках 6 и 7 — генотипа, гомозиготного по мутации (1267) BB. Размер фрагментов ДНК-маркера указан справа, а размеры расщепленных фрагментов приведены слева.

Sequencher™ Software (Version 5.0 build 7081). Частоту встречаемости генотипа вычисляли прямым подсчетом. Различия в частоте встречаемости генотипов HSP среди субъектов исследования с PUD и без язвенной болезни определяли ^-статистикой. Значения отношения шансо

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком