ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 6, с. 784-788
^ ОБЩАЯ
ГЕНЕТИКА
УДК 577.21:598.112
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА 12S рРНК И ФИЛОГЕОГРАФИЯ СРЕДНЕАЗИАТСКОЙ ЧЕРЕПАХИ Agrionemys horsfieldii Gray, 1844
© 2008 г. В. А. Васильев1, Д. А. Бондаренко2, Е. А. Перегонцев3, А. С. Воронов1,
А. П. Рысков1, С. К. Семенова1
1Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: dna@biogen.msk.su
2Головной центр гигиены и эпидемиологии Федерального медико-биологического агентства, Москва 123098 3"Госбиоконтролъ" при Комитете по охране природы Республики Узбекистан, Ташкент 100160, Республика Узбекистан Поступила в редакцию 16.03.2007 г.
На основании внутривидового полиморфизма митохондриального гена 12S рРНК впервые изучена генетическая изменчивость обособленных популяций среднеазиатской черепахи Agrionemys horsfieldii на значительной части ареала, охватывающей Узбекистан, южный Казахстан, северный и восточный Иран. У 59 черепах выявлено четыре гаплотипа, два из которых (АН1 и АН2) были описаны ранее. АН1 характерен для 52 черепах, населяющих территорию южного Казахстана и Узбекистана. Гаплотип АН2 найден у четырех черепах с пограничной территории Узбекистана, Таджикистана и Афганистана. Два новых гаплотипа - АН3 и АН4 - найдены у трех черепах из Ирана. На основании нуклеотидных замен 12S рРНК рассчитано возможное время дивергенции между черепахами из разных частей ареала. Обсуждаются возможные пути формирования современных внутривидовых группировок среднеазиатской черепахи А. horsfieldii.
Ареал среднеазиатской черепахи Agrionemys horsfieldii, Gray, 1844, занимает обширную территорию, охватывающую равнины и низкогорья Узбекистана, Туркменистана, Таджикистана, Киргизии, южного Казахстана, Афганистана, северо-восточного Ирана, северо-западного Китая и северо-западного Пакистана. Среднеазиатскую черепаху выделяют в отдельный род Agrionemys, в котором она представлена единственным видом [1]. Однако некоторые авторы все еще относят A. horsfieldii к роду Testudo или его подроду [2, 3].
Для популяций этого вида характерны морфологические различия по ряду диагностических признаков (цвету, форме верхнего свода карапак-са и переднего края пластрона и т.п.), на основании которых различают три подвида [4]. Отдельные исследователи не совсем обоснованно предложили придать этим подвидам видовой статус [5]. Номинативный подвид A. horsfieldii horsfieldii Gray, 1984, населяет Афганистан, восточную Туркмению и Таджикистан; черепаха Рустамова A. h. rustamovi Ckhikvadze, Amiranshvili et Ataev, 1990, обитает в юго-западной Туркмении; казахстанская черепаха A. h. kazakhstanica Ckhikvadze, 1988, распространена в северной части ареала [1, 4].
Ранее, при изучении полиморфизма отдельных локусов митохондриальной ДНК, и в частности, гена 12S рРНК, у различных видов сухопутных черепах рода Testudo было выявлено высокое разнообразие гаплотипов [6-8]. В то же
время у особей А. horsfieldii из Казахстана и Узбекистана было найдено только два гаплотипа, различающихся одной транзицией [7, 9]. Однако фи-логеография, т.е. территориально-географическое распространение внутривидовых генных потоков в природных популяциях [10] этого вида, не исследовалась. Сравнительный анализ нуклеотидных замен мтДНК показал обоснованность выделения в отдельный род среднеазиатской черепахи [7]. Позднее этот вывод был подтвержден при сравнении ЯАРВ-изменчивости средиземноморских и среднеазиатских черепах [11]. До настоящего времени генетическая изменчивость популяций среднеазиатской черепахи из разных частей ареала остается неизученной. С целью выявления внутривидовой дифференциации А. hors-АеШи на основании внутривидового полиморфизма 12Б рРНК мы впервые провели обследование обособленных популяций на значительной части ареала, охватывающей Узбекистан, южный Казахстан, северный и восточный Иран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Полиморфизм участка митохондриального гена 12Б рРНК изучали на ДНК 59 черепах (29^ и 30 2). Кровь собирали из шейной вены у взрослых особей из природных популяций Узбекистана (п = 45), Казахстана (п = 11) и Ирана (п = 3) в течение 2004-2006 гг. (рис. 1).
Рис. 1. Места сбора образцов крови и распределение МТ-гаплотипов черепах А. horsfieldii на территории Средней Азии. Условные обозначения МТ-гаплотипов: □ - АН1, ■ - АН2, У - АН3 и Д - АН4; цифрами указано количество исследованных особей.
Образцы свежей крови консервировали в 0.05 М ЭДТА (рН 8.0) или 96%-ном этаноле и хранили при температуре 4°С. Выделение тотальной ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным методом [12].
Для амплификации участка митохондриально-го гена 12S рРНК использовали универсальные праймеры 12S - L 01091 (прямой) и H 01478 (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 400 пн [6-8, 13]. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: 94°С -2 мин; 93°С - 1 мин, 50°С - 1 мин, 72°С - 2 мин (35 циклов); 72°- 10 мин. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 60 мМ трис-HCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 0.1% твин-20, 100 мкМ каждого из dNTP, 4 мкМ MgCl2, по 1.5 пкмоль праймеров, 0.6-0.7 ед. Гад-полимеразы ("Dialat", Москва) и 25-100 нг тотальной ДНК. Секвенирование ам-плификантов проводили с двух концов с помощью набора реактивов ABI PRISM®) BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM® 3100-Avant. Выравнивание последовательностей проводили вручную на основании депонированных в GeneBank последовательностей 12S рРНК Г. horsfieldii (AF175328, AB090020). Реконструкцию филогенетических
связей и расчет времени дивергенции гаплотипов проводили с использованием программы MEGA 3 [14]. Для построения дендрограмм использовали двупараметрическую модель Кимуры и NJ-алго-ритм [15, 16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении полиморфизма митохондриаль-ного гена 12S рРНК у 59 представителей среднеазиатской черепахи было выявлено четыре гап-лотипа. Два гаплотипа различались одной транзи-цией (Т - С) в положении 140 пн и были описаны ранее (AF175328, AB090020) для черепах из Средней Азии (географические регионы неизвестны) [7, 9]. Гаплотип АН2 (AB090020) найден нами у четырех черепах, обитающих в районе хребта Ба-батаг (приграничный район Узбекистана с Таджикистаном и Афганистаном). У остальных 52 особей, населяющих территории южного Казахстана и Узбекистана, был выявлен второй известный гаплотип АН1 (AF175328) (рис. 1). У трех черепах из Ирана было найдено два новых гаплотипа - АН3 и АН4, отличающихся от ранее известных последовательностей одной транзици-ей (Т - С) в положении 303 пн. В свою очередь га-плотипы АН3 и АН4 различались одной нуклео-
Распространение и характеристика гаплотипов 12Б рРНК в изученных популяциях двух предполагаемых подвидов среднеазиатской черепахи А. Нок/свШи
Гаплотип Исследовано особей Нуклеотидные замены
обозначе- GeneBank Распространение гаплотипа 140 303 359
ние пн пн пн
АН 1 AF175328 Южный Казахстан и Узбекистан; А. Н. кагакН-Штса 52 Т Т С
АН 2 AB090020 Узбекистан, р-н хребта Бабатаг; А. Н. Ногз/гв1-Ши (?) 4 С Т С
АН 3 Восточный Иран, Моздеванд; северо-восточный Иран, 45 км на с-з от г. Нехбандан; А. Н. horsfiвldii (?) 2 Т С С
АН 4 Северный Иран, долина между хр. Эльбурс и хр. Джагатай; А. Н. Ног8/~1вШй (?) 1 Т С Т
тидной заменой (С - Т) в положении 359 пн (таблица).
Географическое распределение гаплотипов АН1 и АН2 частично совпадает с районами обитания подвидов А. h. horsfieldii и А. h. kazakhstani-са, хотя вопрос о границе их ареалов до сих пор остается открытым. Вероятно, гаплотип АН1 характерен для подвида А. h. kazakhstanica, обитающего на территории Казахстана и большей части Узбекистана
Гаплотип АН2, принадлежащий черепахам, обитающим на границе Узбекистана с Таджикистаном и, по-видимому, на территории Таджикистана, распространен в северо-восточной части ареала номинативного подвида А. h. horsfieldii. Однако, согласно представлениям В.М. Чхиквадзе [4], номинативный подвид населяет не только Таджикистан, но и Афганистан, откуда он был описан, а также южную Туркмению (долина р. Мургаб, северный Копетдаг, Бадхыз). В связи с этим находка в восточном и северо-восточном Иране третьего гаплотипа (АН3), отличного от гаплотипа АН2, представляет значительный интерес. Пункты, в которых обнаружен этот гаплотип, находятся на границе Ирана с Туркменией и Афганистаном и, подобно гаплотипу АН2, также хорошо "укладываются" в ареал номинативного подвида. Гаплотип АН3 принадлежал особям из двух популяций, удаленных друг от друга на 495 км вдоль афганской границы. Очевидно, он распространен значительно шире - на территории Афганистана и южного Туркменистана.
Четвертый гаплотип (АН4) найден у единственной черепахи на севере Ирана (межгорная долина между хребтами Эльбурс и Джагатай), что не позволяет судить о частоте его встречаемости и распространении в популяциях. Вместе с тем нам ничего не известно о полиморфизме гена 12Б рРНК третьего подвида А. h. rustamovi, описанного из юго-западной Туркмении [17]. Если предпо-
ложить, что гаплотип АН4 встречается не только в Иране, но и в Туркмении и характерен для подвида A. h. rustamovi, то ареал этого подвида можно значительно расширить на юг. С другой стороны, судя по описанию, особи A. h. rustamovi имеют мелкие размеры (длина карапакса менее 17 см). Однако обнаруженная нами на территории Ирана самка была крупной, с длиной карапакса 19 см. Поэтому предположение о принадлежности гаплотипа АН4 к A. h. rustamovi менее вероятно, чем признание того, что на севере Ирана обитает A. h. horsfieldii с обозначенным гаплотипом.
На основании полиморфизма гена 12S рРНК были реконструированы возможные филогенетические связи и рассчитано возможное время дивергенции исследованных подвидов (форм) среднеазиатской черепахи (рис. 2). Для оценки времени дивергенции мы принимали скорость замен, равную 0.3% за 1 млн. лет, предложенную ранее для сравнения мтДНК черепах разных семейств [6, 7]. Наиболее древним гаплотипом можно считать, вероятно, последовательность АН2, найденную у черепах из Бабатага. Она характерна для представителей современного подвида A. h. horsfieldii,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.