МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 595-600
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 575.174:599.9
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА ШЕСТОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ ^БИ-ДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА (N06) У РУССКОГО НАСЕЛЕНИЯ РОССИИ
© 2003 г. И. В. Корниенко, Д. И. Водолажский, Л. С. Михалкович, Г. Н. Павличенко1, П. Л. Иванов2, 3*
Центральная лаборатория медико-криминалистической идентификации Министерства обороны
Российской Федерации, Ростов-на-Дону, 344010 Научно-исследовательский институт нейрокибернетики им. А.Б. Когана Ростовского государственного
университета, Ростов-на-Дону, 344090 2Российский центр судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации,
Москва, 115035
3Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 117984
Поступила в редакцию 17.02.2003 г.
Представлены результаты экспериментального исследования полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена шестой субъединицы КАБИ-дегидрогеназного комплекса (N06) мтДНК в выборке русского населения Российской Федерации. Эта область картируется между позициями 14170 и 14569 мтДНК. Величина генетического разнообразия гаплотипов N06 в исследованной выборке составляет 0.406; вероятность случайного совпадения гаплотипов составляет 0.598. Таким образом, анализ полиморфизма локуса N06 в дополнение к типированию контрольного участка мтДНК может повысить надежность судебно-экспертных идентификационных исследований. Отмечается, что некоторые точковые замены в области N06 оказываются ассоциированными с некоторыми транзициями в области контрольного участка мтДНК Наблюдаемые закономерности проанализированы при помощи коэффициента сопряженности (фи-коэффициента).
Ключевые слова: митохондриальная ДНК, ген шестой субъединицы NA0H-дегидрогеназного комплекса, секвенирование ДНК, полиморфизм ДНК, молекулярно-генетическая идентификация.
В последнее десятилетие молекулярно-генети-ческие маркеры митохондриальной ДНК (мтДНК) широко используются в области судебной медицины при идентификации личности человека [1-3]. Высокая копийность мтДНК в клетке значительно повышает вероятность сохранности какого-то минимального количества интактных молекул даже в сильно деградированных образцах. Поэтому исследование мтДНК позволяет проводить молекулярно-генетическое типирование биологических образцов, изучение которых другими методами анализа ДНК не представляется возможным, например, фрагментов древних костей, ногтей, стержней волос, следов слюны [4-7]. Однако к числу недостатков генетических маркеров митохондриального генома, в аспекте их использования для целей идентификации личности, можно отнести то, что имеется лишь небольшое число "освоенных" полиморфных локусов (по сравнению с ядерной ДНК). Следствием этого оказывается недостаточная "индивидуализирующая" значимость исследуемых комплексов при-
* Эл. почта: pavel-ivanov@mtu-net.ru
знаков при судебно-экспертном типировании мтДНК.
Область структурных генов мтДНК, как правило, не используется при молекулярно-генети-ческой индивидуализации человека, за исключением единственного участка, в котором локализовано большинство точковых нуклеотидных замен. Это некодирующая область контрольного региона 0-петли. Между тем, многие структурные гены мтДНК также полиморфны [8, 9].
Индивидуальная вариабельность различных локусов мтДНК увеличивается в ряду - гены рРНК, гены тРНК, гены трех субъединиц цито-хромоксидазы и апоцитохрома Ь, гены двух субъединиц АТРазы и семи субъединиц NA0И-дегид-рогеназного комплекса и, наконец, последовательность 0-петли [10, 11]. Таким образом, степень полиморфизма локусов NADH-дегидро-геназного комплекса оказывается выше, чем у всех других групп структурных генов митохондриального генома [10-13].
Эволюционная изменчивость структурных ми-тохондриальных генов также неодинакова. Наиболее консервативным является ген субъедини-
595
3*
цы I цитохромоксидазы, а гены пятой и шестой субъединиц NADH-дегидрогеназного комплекса и восьмой субъединицы АТРазы характеризуются наибольшей изменчивостью в процессе эволюции организмов [11, 14]. Примечательно, что скорость мутирования гена шестой субъединицы (ND6) NADH-дегидрогеназного комплекса в полтора раза выше, чем гена пятой субъединицы [12].
Можно предположить, что использование в качестве маркерных элементов вариантов полиморфизма структурных генов митохондриально-го генома позволило бы повысить дискриминирующую способность молекулярно-генетического идентификационного анализа, осуществляемого на уровне мтДНК.
В настоящей работе мы провели исследование характеристик полиморфизма структурного гена ND6 мтДНК среди русского населения Российской Федерации как самой представительной этнической группы. Ген ND6 выбран в качестве генетического маркера как высокополиморфный [13]; сравнительно небольшой размер локуса ND6 позволяет проводить его анализ даже в тех случаях, когда биологический образец частично деградирован.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
ДНК для типирования гена 6-й субъединицы NADH-дегидрогеназного комплекса мтДНК выделяли из образцов периферической крови, полученной от 86 неродственных индивидов - русских из 30 регионов Российской Федерации, с использованием ионообменного композита Chelex 100 [15]. Этническую принадлежность доноров определяли по паспортным данным и по доступной информации о ближайших кровных родственниках. Паспортизованные образцы крови включались в банк данных биологических проб 124 Центральной лаборатории медико-криминалистической идентификации МО РФ.
Амплификацию локуса ND6 мтДНК с помощью полимеразной цепной реакции проводили с использованием праймеров F14130 (3'-cctactcctaat-cacataac-5') и R14690 (3'-tagtccgtgcgagaataatg-5'). Амплификацию контрольного участка мтДНК проводили с помощью праймеров F15971 (5'-ttaactccaccattagcacc-3') и R16410 (5'-gaggatggtggt-caagggac-3'); F15 (5'-caccctattaaccactcacg-3') и R448 (5'-tgagattagtagtatgggag-3').
Амплифицированные участки мтДНК секве-нировали с помощью набора реагентов BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ("PE Applied Biosystems") с использованием флуоресцентно меченных дидезоксинуклеозидтрифос-фатов. Фракционирование терминированных продуктов секвенирующих реакций проводили в 4.5%-ном полиакриламидном денатурирующем
геле на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377 ("PE Applied Biosystems"). Данные о первичной структуре ДНК расшифровывали с помощью программного пакета "DNA Sequencing Analysis Software, version 3.1" ("PE Applied Biosystems"). Сравнительный анализ выполняли с помощью программы Sequence Navigator, version 1.01 ("PE Applied Biosystems"). Полиморфизм нуклеотид-ных последовательностей гена ND6 определяли в сравнении с референтной последовательностью мтДНК [16]. Проводили секвенирование как легкой (L), так и тяжелой (H) цепей гена ND6.
Для количественной характеристики ассоциаций точковых нуклеотидных замен использовали коэффициент сопряженности (коэффициент ф) [17]. Фи-коэффициент рассчитывали по формуле [18]:
ф = 7(х2/n..),
где х2 - статистика хи-квадрат без поправок, п.. -общий объем выборки.
X2 рассчитывали по формуле [17]:
22 X = П.. ( Пп П22- П^П21) /П1.П2.ПЛП.2,
где х2 - статистика хи-квадрат без поправок; п.. -общий объем выборки; пп - количество гаплоти-пов, в которых изменения в сравниваемых позициях 1 и 2 происходили одновременно; п12 - количество гаплотипов, в которых изменения происходили только в позиции 1; п21 - количество гаплотипов, в которых изменения происходили только в позиции 2; п22 - количество гаплотипов, в которых не отмечено изменений ни в одной из сравниваемых позиций.
n = п
11 + "12>
п2 = п
21 + "22>
п .2 = п12 + п22.
П I = п
11 + "21>
Величину разнообразия гаплотипов (h) оценивали по формуле [19]:
h = п (1- £)/(п -1),
где f - частота встречаемости /-го гаплотипа, п -величина выборки.
Вероятность случайного совпадения (MP) рассчитывали по формуле [20]:
MP = £ P2, где Pi - частота встречаемости каждого гаплотипа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нами изучена вариабельность участка структурного гена ND6 мтДНК длиной 400 п.н. у 86 русских. Все варианты первичной последовательности гена ND6 в этой выборке определены путем секвенирования легкой (L) и тяжелой (H) цепей
1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111И 666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666 000001111111111111111111111111222222222222222222222222222333333333353333 3 67 991223444445 667777888888 999022222334455 666677778 999999011222244455556 1902 34 696045673 68012 92 34 58 923331234714 8 969015 6014 8 6012 4 68 41904 57234 45672
0000000000000000000000000000000 11111111111 0000000000000000000000000000000 44444444444 0011111111111112222222222223333 122222334 45 79455588888 999900023344 688 90011 801237 6667 6 33 60122 5 68 94 58 9047 84 92 932 559905 20233245109
12 1
12
АСАТТСТСТТТСАССАСААТСААСССТС--АСССТАТССТССССАССТССССССССТТТССТТСТАСССТТТ ААТССТСССААСТСТАТССАТСААТСС--Т- ТТТААСССТТС
.ТТ.С.............. С.
ТТ.................
.тт...............с о.
.ттс..............................с.
.тт.с............................с.
.тт.....с....................о.
.ТТ.С..............
.тт.с.............. с.
.сс.с ____с.
.в. . .СС.С .........А.
.6......с ...........
.......................................................с......в......с
......................................С ....................С. .6. . .с. .с
.......т.....Т......................... 6......................6. ..сс.с
.с.......................с............. с.с. .с.................с.. .с. .с
т...................................е.. 6...........С..........6.....ст..............А____Т.................. С.........СТС...СА.....в... е.. С
.С.............................С........Т.......................... е.С. .С.................С......С
.С.......................6.....................Т____С.............. 6.....................-с......с
.С. . . .А.......С............Т..........Т.................................................Т.О. .Т. . .С
в____С____С.С.С.СА.С.
...................С. . .С. .С
...А.С
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.