научная статья по теме ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМА ЛЬНА ПОСЕВНОГО ПО МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИМ МАРКЕРАМ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМА ЛЬНА ПОСЕВНОГО ПО МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИМ МАРКЕРАМ»

ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ

УДК 575.853316.7:576.316.7:582.751.42

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМА ЛЬНА ПОСЕВНОГО ПО МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИМ МАРКЕРАМ

© 2011 г. О. А. Рачинская1, В. А. Лемеш2, О. В. Муравенко1, О. Ю. Юркевич1, Е. В. Гузенко2, Н. Л. Большева1, М. В. Богданова2, Т. Е. Саматадзе1, К. В. Попов1, С. В. Малышев2, Н. Г. Шостак1, К. Xеллер3, Л. В. Хотылева2, А. В. Зеленин1

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва 119991; e-mail: azel@eimb.ru

2Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072;

e-mail: v.lemesh@igc.bas-net.by 3Институт натуральных волокон, Познань PL60630, Польша; e-mail: khel@inf.poznan.pl Поступила в редакцию 05.05.2010 г.

C помощью комплекса методов, основанных на использовании молекулярно-цитогенетических маркеров (DAPI/C-бэндинг, определение суммарной площади DAPI-позитивных районов в про-фазных ядрах, FISH с зондами 26S и 5S рДНК) и микросателлитного (SSR-PCR) анализа, изучен геномный полиморфизм 15 сортов льна посевного различного географического происхождения, принадлежащих к трем направлениям селекции — масличному, волокнистому (долгунцовые формы) и промежуточному (межеумки), а также одного гибрида к37 х Viking. В кариотипах исследованных сортов по рисункам DAPI/C-дифференциального окрашивания и распределения 26S и 5S рДНК идентифицированы все индивидуальные хромосомы и составлены их идиограммы. В отличие от масличных сортов хромосомы в кариотипах долгунцовых сортов имеют, как правило, меньшие размеры околоцентромерных и теломерных DAPI-позитивных бэндов, но содержат более крупные ин-теркалярные районы. Обнаружены две хромосомные перестройки (инверсии хромосомы 3) у сорта Luna и у гибрида к37 х Viking. У этих же форм практически отсутствует колокализация 26S рДНК с 5S рДНК на спутничной хромосоме. Для проведения SSR-анализа было использовано 20 полиморфных пар праймеров, которые выявили 22 полиморфных локуса. Полученная SSR-база данных позволила провести анализ генетического сходства изученных форм льна и построить дендрограм-му генетического подобия. Исследованные генотипы сформировали три кластера. Масличные сорта объединились в самостоятельный кластер. При этом генетически близкие сорта Вита, Luna и ландраса Lipinska XIII оказались ближе, чем остальные сорта долгунцов, к масличным сортам льна. Результаты молекулярно-хромосомного анализа долгунцов и масличных льнов подтверждают, что эти разновидности генетически очень близки. Несмотря на это, сочетанное использование хромосомных и молекулярных маркеров открыло уникальные возможности для описания генотипов сортов и создания их генетических паспортов.

Важнейшая техническая культура — лен посевной (Linum usitatissimum L.) со второго тысячелетия до нашей эры возделывается на территории Нечерноземья. L. usitatissimum представляет собой полиморфный вид, включающий огромное количество разнообразных сортов. Современные систематики выделяют подвид subsp. intermedium Czer. — лен промежуточный, или межеумок, и две основные разновидности L. usitatissimum: var. usitatissimum — лен-долгунец, var. humile Mill. — лен-кудряш или масличный [1]. Лен-долгунец возделывают для получения волокна, а лен-кудряш и межеумок — для получения масла. Широкое использование льна, являющегося ценнейшим сырьем для промышленности, обусловливает необходимость получения все новых высокопродуктивных и устойчивых сортов, что требует хороших

знаний его генетических особенностей. В первую очередь, для характеристики сортоспецифических особенностей льна посевного необходимо оценить внутривидовую изменчивость его генома.

В цикле работ, проведенных Каллисом и его соавторами, была выявлена уникально высокая пластичность генома льна в зависимости от условий произрастания [2, 3]. Это послужило хорошим стимулом к изучению межсортового геномного полиморфизма льнов с помощью различных подходов. RAPD- и AFLP-анализы геномов сортов льна посевного, а также его ближайших дикорастущих сородичей (L. angustifolium Huds. и L. bien-ne Mill.) выявили четкое разделение сортов льна на группы в зависимости от места их происхождения и произрастания и продемонстрировали низкий геномный полиморфизм внутри этих групп

Таблица 1. Происхождение и селекционная направленность изученных сортов льна посевного

№ Название образца Тип Страна происхождения Источник получения

1 Славный 82 Долгунец Россия Беларусь, Институт льна

2 Светоч » » То же

3 Прамень » Беларусь »

4 Форт » » »

5 Томский 16 » Россия »

6 Вита » Беларусь »

7 Старт » » Беларусь, Могилевская опытная станция

8 Luna (INF-788) » Польша Польша, Институт натуральных волокон

9 Небесный Масличный Россия Беларусь, Институт льна

10 Ручеек » » То же

11 Gold Flax » Канада »

12 Bison » США Россия, ВНИИЛ

13 Lola (INF-843) » Чехия Польша, Институт натуральных волокон

14 Alaska (INF-881) » Франция То же

15 Lipinska XIII (INF-404) Межеумок Польша »

16 к-37 x Viking* Гибрид Беларусь Институт генетики и цитологии НАН Беларуси

* Гибрид от скрещивания ландрасы долгунцового типа к-37 (Беларусь) с сортом льна-долгунца Viking (Франция).

[4—6]. Было обнаружено, что RAPD-маркеры дают возможность достоверно дифференцировать дикорастущие льны [6—9] и масличные сорта [5, 7, 10], однако возникали трудности с идентификацией сортов льна-долгунца. Можно предположить, что это обусловлено недостаточно высокой разрешающей способностью RAPD-метода. Для более точного анализа полиморфизма близкородственных генотипов льна был применен метод микросателлитного анализа (SSR-PCR), с помощью которого удалось выявить некоторые дополнительные особенности геномов ряда масличных и долгунцовых сортов льна [11].

Работ, посвященных исследованию внутривидовой хромосомной изменчивости льна, очень мало. Идентифицировать мелкие хромосомы льна посевного и его дикорастущих сородичей удалось только авторам настоящей работы с помощью методов С-, DAPI-окрашивания хромосом и FISH с зондами генов 26S и 5S рРНК [12-17].

Ранее проводимые исследования кариотипов шести разных сортов L. usitatissimum выявили межсортовой полиморфизм С-бэндов хромосом, а также обнаружили различия по суммарному количеству гетерохроматина в профазных ядрах между масличными и долгунцовыми сортами льна [13]. Однако, хотя при изучении и геномного и хромосомного полиморфизма были выявлены сортоспецифические особенности, многие вопросы остались нерешенными. В частности, хромосомный и геномный полиморфизм внутри долгунцов, кудряшей и межеумков во многих случаях перекрывался, и особенности геномов сортов льна из этих групп не всегда четко выявлялись. С целью поиска дополнительных характеристик генома льна посевного мы предприняли

одновременное исследование хромосомного и геномного полиморфизма у ряда неизученных ранее сортов льнов-долгунцов, масличных и межеумков. Такой комбинированный подход с использованием цитогенетических и молекулярных маркеров может значительно повысить разрешающую способность генетического анализа, что было показано нами ранее в процессе изучения геномов льна посевного и его диких сородичей [14, 15, 18].

В настоящей работе был изучен полиморфизм геномов 15 сортов льна посевного различного географического происхождения с параллельным использованием молекулярно-цитогенетических маркеров (DAPI/C-бэндинг, FISH с зондами 26S и 5S рДНК) и метода микросателлитного (SSR-PCR) анализа генома.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изученный материал. Материалом для исследования послужили восемь сортов льна-долгунца, шесть сортов льна-кудряша, одна ландраса и один гибрид между ландрасой к-37 и льном-долгунцом Viking (к-37 х Viking). Перечень изученных образцов представлен в табл. 1.

Хромосомные препараты. При приготовлении хромосомных препаратов использовали технологию, разработанную ранее [14, 19, 20].

У проростков отрезали кончики корешков 1— 1.5 см и обрабатывали 1 х 10-6 раствором интерка-лятора ДНК 9-аминоакридином (1 мкг/мл, "Sigma", США) при температуре от 0 до 4°C в течение 10 ч. Корни фиксировали в фиксаторе Карнуа 3 : 1 (этанол : ледяная уксусная кислота) в течение суток. Окраска корешков производилась 1%-ным

раствором ацетокармина, после чего готовились давленые препараты.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). FISH проводили, используя пробы генов 26S и 5S рРНК, полученные с помощью ПЦР из геномной ДНК L. austriacum L. по ранее описанной методике [16, 20]. Пробу 26S рДНК метили биоти-ном с помощью набора Bio Nick translation kit ("Roche", США), а пробу 5S рДНК - дигоксиге-нином с помощью Dig Nick translation kit ("Roche", США). Для выявления сайтов гибридизации зонда 5S рДНК использовали антитела к ди-гоксигенину, конъюгированные с родамином ("Roche", США), а для выявления локализации зовдд 26S рДНК — авидин-флуоресцеин ("Vector", США).

DAPI/С-бэндинг. Для флуоресцентного окрашивания хромосом в среду для заключения препаратов CITIFLUOR (UKC CHEM.LAB) добавляли 0.125 мкг/мл 4,6-диамидино-2-фенилиндо-ла (DAPI, Serva). После гибридизации in situ на хромосомах льна выявлялся рисунок DAPI-бэн-динга, который был схож с рисунком С-окраски хромосом (DAPI/C-бэндинг).

На флуоресцентном микроскопе Olimpus BX61 отобранные хромосомные пластинки фотографировали с помощью черно-белой ПЗС камеры CoolSnap ("RoperScientific Inc.", CША). Полученные изображения обрабатывали, используя программы хромосомного анализа, согласно технологии, принятой в лаборатории [14].

Анализ средней суммарной площади DAPI-пози-тивно окрашенных районов профазных ядер. Суммарную площадь DAPI-позитивно окрашенных районов в профазных ядрах определяли с помощью процедуры яркостной сегментации. Для каждого образца было проанализировано не менее 35 ядер. Измерения и статистический анализ полученных данных проводили по предложенной ранее методике [13] при использовании компьютерных программ анализа изображения "Видео-ТесТКарио 3.0" (ВидеоТест, Санкт-Петербург) и "ImageJ 1.38" (www.rsb.info.nih.gov/ij/).

SSR-анализ. SSR-анализ проводили для 15 сортов льна. ДНК выделяли из проростков с помощью Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas"). Реакционная смесь д

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком