МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 638-648
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 575.852:577.151
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ bphA БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ БИФЕНИЛА/ХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ
© 2015 г. Е. С. Шумкова1' 2*, Д. О. Егорова2, С. В. Боронникова3, Е. Г. Плотникова2, 3
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь, 614081 3Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990
Поступила в редакцию 30.10.2014 г. Принята к печати 05.02.2015 г.
Полихлорированные бифенилы относятся к группе стойких органических загрязнителей окружающей среды. Бифенил-2'3-диоксигеназа (БДО) — ключевой фермент, определяющий спектр окисляемых бактериями полихлорбифенилов (ПХБ). а-Субъединица (BphAl) БДО играет основную роль в распознавании и связывании субстрата. Проведен скрининг и филогенетический анализ генов диоксигеназ, гидрок-силирующих ароматическое кольцо. У деструкторов бифенила Rhodococcus erythropolis G12a, B7b, B106a обнаружены гены, сходные с ранее опубликованными нуклеотидными последовательностями генов bphA1 Rhodococcus sp. HA99, R04 и Novosphingobium aromaticivorans F199, кодирующих а-субъеди-ницы, не входящие в семейство бифенил/толуолдиоксигеназ (Б/ТДО). У штамма R. ruber P25 (деструктор ПХБ) выявлен уникальный ген bphA1, попадающий в один кластер с генами а-субъединиц фенилпропи-онатдиоксигеназ (ФПДО) Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 и Frankia sp. Eullc. Проведен анализ дедуктивных аминокислотных последовательностей выявленных генов. Аминокислоты активного центра БДО штаммов R. wratislaviensis Pl, P12, P13, P20 (содержат гены bphA1 семейства Б/ТДО) совпали с таковыми для БДО активного деструктора ПХБ R. jostii RHA1. Показано, что исследуемые родококки активны в отношнии как орто-, так и иара-хлорированного кольца 2,4'-дихлорбифенила. У бактерий Pseudomonas sp. S9, S13, S210, S211, S212 аминокислоты а-субъединицы (семейство Б/ТДО), определяющие субстратную специфичность фермента, совпадают с таковыми у P. pseudoalcaligenes KF707. Псевдомонады оказались активны по отношению к иара-хлорированному кольцу 2,4'-дихлорбифенила. Результаты скрининга бактериальных штаммов на наличие генов bphA1 могут быть использованы для выявления перспективных для решения задач биотехнологии деструкторов ПХБ.
Ключевые слова: Rhodococcus, Pseudomonas, бифенил, полихлорированные бифенилы, полиморфизм генов, bph гены, бифенил-2,3-диоксигеназа.
POLYMORPHISM OF bphA GENES IN BACTERIA-DESTRUCTORS OF BIPHENYL/CHLORINAT-ED BIPHENYLS, by E. S. Shumkova12*, D. O. Egorova2, S. V. Boronnikova3, E. G. Plotnikova2 3 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: ekaterinash80@mail.ru; 2Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Division, Russian Academy of Sciences, Perm, 614081 Russia; 3Perm State University, Perm, 614990 Russia). Polychlorinated biphe-nyls belong to a group of persistent organic pollutants. Biphenyl 2,3-dioxygenase is a key enzyme that determines the range of polychlorinated biphenyls oxidized by bacterial strain. Biphenyl dioxygenase a-subunit (BphA1) plays a key role in the substrate recognition and binding. Screening and phylogenetic analysis of genes of dioxygenases (naphthalene- and biphenyl dioxygenases) that hydroxylate aromatic rings were carried out. Genes bphA1 that were found in biphenyl oxidizing strains of Rhodococcus erythropolis G12a, B7b, B106a were similar to earlier published bphA1 nucleotide sequences of Rhodococcus sp. HA99, R04 and Novosphingobium aromaticivorans F199. These genes were phylogenetically closer to the genes of polyaromatic compound diox-ygenases a-subunits, then to the biphenyl/toluene dioxygenase family. Strain R. ruber P25 (degrader of poly-chlorbiphenyls) contained the unique gene bphA1 falling within the same cluster of the genes of phenyl propionate dioxygenase a-subunits of Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 and Frankia sp. EuI1c. The analysis of the amino acid sequences obtained as a result of virtual translation of the bphA1 genes was conducted. The amino acids of biphenyl dioxygenases active centre of R. wratislaviensis P1, P12, P13, P20 (containing the bphA1 genes of biphenyl/toluene dioxygenase family) were identical to amino acids of active degrader of polychlorbi-
Принятые сокращения: БДО — бифенилдиоксигеназа; НДО — нафталиндиоксигеназа; ФПДО — фенилпропионатдиокси-геназа; Б/ТДО — бифенил/толуолдиоксигеназа; ПХБ — полихлорированные бифенилы.
* Эл. почта: ekaterinash80@mail.ru
phenyls R. jostii RHA1. Rhodococci under study exhibited the activity both to ortho- andpara-chlorinated ring of 2,4'-dichlorbiphenyl. It was found that in Pseudomonas sp. S9, S13, S210, S211, S212 the a-subunit amino acids (biphenyl/toluene dioxygenase family) that determined the enzyme substrate specificity agreed with those from P. pseudoalcaligenes KF707. Pseudomonads were active against para-chlorinated ring of 2,4'-dichlorbi-phenyl. Bacterial strains' screening for the bphA1 genes and their analysis could be used to find biotechnologi-cally promising degraders of polychlorbiphenyls.
Keywords: Rhodococcus, Pseudomonas, biphenyl, polychlorinated biphenyls, polymorphism of the bphA genes, biphenyl 2,3-dioxygenase.
DOI: 10.7868/S0026898415040151
Различные соединения группы бифенилов присутствуют в природной среде в составе нефти, каменноугольной смолы, природного газа [1], в то время как полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к ксенобиотикам антропогенного происхождения, попавшим в окружающую среду в течение последнего столетия. Это стойкие токсичные соединения, производство и применение которых запрещено в 2001 году Стокгольмской Конвенцией [2]. В связи с этим представляет интерес изучение ферментов, детерминирующих способность бактерий к деструкции как природных соединений, так и появившихся в природе относительно недавно. Вопрос о происхождении генов, позволяющих бактериям использовать хлорированные бифенилы и их смеси в качестве субстратов, остается дискуссионным [3]. Знания о путях их эволюции позволят более эффективно решать прикладные проблемы, такие как целенаправленное изменение свойств фермента для повышения его активности в отношении того или иного субстрата [4].
В аэробных условиях бактериальная деструкция бифенила и его хлорпроизводных происходит по следующему механизму: окисление одного из ароматических колец с последующим его расщеплением. Первая реакция — включение двух гидрок-сильных групп в ароматическое кольцо бифени-ла/ПХБ — присходит под действием фермента би-фенил—2,3-диоксигеназы (БДО). Субстратная специфичность этого фермента определяет спектр конвертируемых бактериальной клеткой изомеров ПХБ.
БДО — мультикомпонентный фермент, включающий белки электрон-транспортной системы и терминальной оксигеназы, представляющей собой гексамер из трех а- и трех Р-субъединиц (соответственно BphAl и BphA2). Считается, что именно а-субъединица играет ключевую роль в распознавании и связывании субстрата [5]. Каждая а-субъединица содержит кластер Риске [2Fe-2S], координированный двумя остатками His и двумя остатками Cys, и, в составе активного центра, не-гемовое железо (II), координированное двумя остатками His, одним Asp и молекулой воды [6]. В основном исследованы БДО грамотрицательных
бактерий. Есть данные о структуре и особенностях взаимодействия БДО Burkholderia xenovorans LB400 [7—9], Pandoraea promenusa B-356 [10] и Sphingobium yanoikuyae B1 с бифенилом, хлорби-фенилами, хлордибензофураном [11]. Известна структура БДО только одной грамположительной бактерии — Rhodococcus jostii RHA1 [12, 13]. Показано, что взаимодействие с субстратом сопровождается существенными конформационными изменениями каталитического кармана фермента. Аминокислотные остатки каталитического кармана можно подразделить на 3 группы: каталитические, ориентирующие положение субстрата и ответственные за конформационные изменения [13].
В работах по исследованию взаимосвязи структуры и функции БДО показано, что замена некоторых аминокислот в составе а-субъединицы приводит к инактивации фермента или серьезным изменениям его субстратной специфичности [14].
По классификации Gibson & Parales [15], основанной на сравнении генов а-субъединиц гидрок-силирующих диоксигеназ, большинство известных ферментов, осуществляющих гидроксилиро-вание бифенила/ПХБ, относится к семейству бифенил/толуолдиоксигеназ (Б/ТДО) [15—17]. Однако известны диоксигеназы бифенила, существенно отличающиеся от ферментов вышеупомянутого семейства, в частности у бактерий рода Rhodococcus [18, 19] и Novosphingobium [20].
Результаты исследований, проведенных с использованием методов высокопроизводительного секвенирования, свидетельствуют об огромном разнообразии ароматических диоксигеназ, в том числе БДО, в почве, донных отложениях и других компонентах окружающей среды [21—25]. Показано, что диоксигеназы культивируемых бактерий составляют лишь небольшую часть по сравнению с многообразием БДО в метагеноме микробного сообщества почвы [21, 26].
Ранее нами проведен скрининг аэробных бактерий-деструкторов бифенила, выделенных из почв, загрязненных отходами производства гало-генированных органических/неорганических соединений, на наличие в них генов bphA1, кодирующих а-субъединицы семейства Б/ТДО [27, 28]. Для ПЦР-анализа мы использовали праймеры,
специфичные именно к этой группе генов и обнаружили, что для некоторых активных деструкторов бифенила, в том числе для деструктора ПХБ R ruber P25, не происходит амплификации искомого гена. Оставалось предположить, что ключевые ферменты деструкции бифенила таких бактерий существенно отличаются от ферментов семейства Б/ТДО.
Цель проведенного исследования состояла в том, чтобы, во-первых, выявить гены bphA1 у этих бактерий; во-вторых, получить более полную информацию о генах bphAl, кодирующих а-субъ-единицы, относящиеся к семейству Б/ТДО, в частности об участках
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.