РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 63-69
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ HLA DRB1^ ИЖ^ И шр* У ЖЕНЩИН C РЕПРОДУКТИВНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ
© 2008 г. А.В. Шабалдин*, Л.А. Гордеева*, О.А. Глушкова*, О.С. Макарченко*, Т.А. Симонова**, М.Л. Филипенко***,
А.Н. Глушков*
*Институт экологии человека СО РАН, Кемерово, Россия;
**Кемеровский областной перинатальный центр, Кемерово, Россия;
***Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия
Поступила: 12.09.07 г. Принята: 18.12.07 г.
Исследования в отдельных популяциях показали, что маркерами идиопатических потерь плода могут быть аллели ШЛ DRB1*, ^Ша* и ^1р*. Однако остается неизвестным, как сочетаются при нарушениях репродукции аллели НЬЛ DRB1*, детерминирующие иммунное распознавание, и аллели Ш, детерминирующие цитокиновую регуляцию вынашивания беременности. Целью настоящей работы был поиск ассоциаций полиморфизмов генов с репродуктивными нарушениями. Провели обследование 161 женщины в возрасте от 18 до 43 лет, проживающих на территории Кемеровской области. Группу сравнения составили 84 женщины с физиологическим течением беременности, в сроки беременности 15 — 22 недели и отсутствием в анамнезе спонтанных абортов и врожденных пороков развития плода. Основную исследуемую группу составили 77 женщин с потерями плода неясной этиологии или с диагнозом бесплодие (11-го типа). Полиморфизм генов ШЛ DRB1*, ^Ша* и ^ф* исследовали с помощью ПЦР. Обнаружили положительную ассоциацию данной патологии с сочетанием аллеля НЬЛ DRB1*04 (возможно гомозиготного генотипа ШЛ DRB1*04,04) с генотипами IL1Rа*4R/4R и Шр*С/С ^ = 10,10; С1 = 3,86-26,43; X2 = 10,58, р < 0,01). Риск формирования репродуктивных потерь у женщин при этом сочетании составил более 90%. Полученные результаты расширяют возможности генетического прогнозирования индивидуального риска бесплодия и репродуктивных нарушений неясной этиологии.
Ключевые слова: НЬЛ DRB1*, ^Ша*, шр*, репродуктивные нарушения
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что формирование и вынашивание беременности является иммунным процессом, рестриктированным по антигенам (АГ) главного комплекса гистосовместимости (ИЬЛ). Ввиду того, что презентирующими молекулами являются эмбриональные АГ тканевой совместимости (ИЬЛ G), происходит принципиальное изменение иммунного эф-
Адрес: 650099, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, 10, Институт экологии человека СО РАН, отдел молекулярной экологии человека. E-mail: ihe@kemtel.ru; gorsib@rambler.ru
фекта: блокируются Т-киллеры и активируются Т-хелперы II типа, что способствует приживлению полуаллогенного оплодотворенного яйца [1]. Этот каскад взаимодействий регулируется некоторыми цитокинами (1Ь-1, 1Ь-4) [2, 3]. В настоящее время показан полиморфизм не только в генах ИЬЛ, но и генах цито-кинов, поэтому поиск генетических маркеров иммунных форм репродуктивных нарушений значительно расширился [4, 5]. С позиции генетических сетей наиболее эффективно проводить поисковый скрининг по локусам, ответственным за различные звенья патогенеза того или иного заболевания. В связи с этим целью настоящей работы был анализ ассоциаций полиморфизмов генов, детерминирующих иммунное распознавание при формиро-
вании беременности (HLA DRB1*) и иммунную регуляцию вынашивания беременности (1ЬШа, 1Ь1), у женщин с репродуктивными нарушениями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведено обследование 161 женщин в возрасте от 18 до 43 лет, проживающих на территории Кемеровской области и наблюдавшихся в Кемеровском областном перинатальном центре.
Группу сравнения (группа I) составили 84 женщины с физиологическим течением беременности, в сроки беременности 15 — 22 недели, и отсутствием в анамнезе спонтанных абортов и врожденных пороков развития плода.
Основную исследуемую группу (группа II) составили 77 женщин с потерями плода неясной этиологии или с диагнозом бесплодие (11-го типа).
У всех женщин с потерями плода в ранние сроки беременности (до 15 недель) были исключены анатомические, инфекционные и гормональные аномалии, а также нарушения в спермограмме супруга. Основанием для включения в исследовательскую группу женщин с бесплодием явилось также отсутствие у них гормональных, инфекционных и анатомических нарушений, тормозящих формирование беременности, и наличие нормальных показателей спермограммы у мужчин.
У всех обследованных забирали венозную кровь, из лимфоцитов которой выделяли геномную ДНК с помощью метода фенол-хлороформной экстракции [6], образцы ДНК растворяли в 10 тМ Tris/1 EDTA, рН 8,0 и хранили при 4 °С.
Для типирования гена НЬЛ DRB1* использовали коммерческую тест-систему НЬЛ-ДНК-ТЕХ (фирма «НПФ ДНК-технология», Россия). Двухэтапную ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («НПФ ДНК-технология», Россия) по программам, рекомендованным производителем набора. Детекцию продуктов амплификации проводили при помощи электрофореза в 3% ага-розном геле (рис. 1а).
Исследование полиморфизма 1ЬШа проводили с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находятся вариабельное количество тандемных повторов —
86 н.п. (VNTR). Для амплификации использовали олигонуклеотидные праймеры, выбранные с помощью программы GENERUNNER на основании нуклеотидной последовательности гена ILIRa* (GENEBANK, U65590). В результате амплификации детектировали фрагменты ДНК размером 438, 524, 610, и 696 н.п. с 2, 3, 4 или 5 тандемными повторами, соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R и в данном исследовании соответствовали аллелям ILIRa 2, 3, 1, 4 (рис. 1б).
Точковая мутация в 3953 положении 5 экзона гена IL1p по ходу транскрипции происходит за счет замены цитозина на ти-мин (SNP IL-1 р ( + 3953) С ^ T), тем самым создавая два аллеля. Для детекции описанного полиморфизма на первом этапе проводили амплификацию со специфическими праймерами на фрагмент экзона 5, содержащий эту нуклеотидную замену. Праймеры, сконструированные на основе последовательности гена IL-1p (Х04500), давали при проведении ПЦР фрагмент ДНК размером 550 н.п. (IL-1p-550).
SNP IL-1p ( + 3953) С ^ T выявляли при помощи полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), используя рестриктазу TaqI, для которой при замене С на T нарушался сайт рестрикции. При наличии аллеля С в результате рестрикции TaqI получались два фрагмента размером 146 и 404 н.п. Аллель Т давал один фрагмент размером 550 н.п. В случае гетерозиготы присутствовали все три фрагмента (рис. 1 в).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ППП «Statistika for WINDOWS 5.0». Соответствие с равновесием Харди-Вайн-берга частот генотипов изучаемых полиморфизмов в контрольной группе и группе сравнения проверяли с помощью критерия х2 (модуль «Nonparametrics/Distrib»). Анализ распределения частот генотипов HLA DRB1*, IL1Ra* и IL1p* у женщин обследуемых групп показал их соответствие ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга (p > 0,05).
Проверку гипотезы о равенстве относительных частот аллелей HLA DRB1*, IL1Ra* и ILip* в исследуемых группах женщин проводили с помощью четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации (%2, модуль «Nonparametrics/Distrib»). Нулевую гипотезу отвергали при ошибке достоверности менее 5%, что со-
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации генов ^А DRB1*, ^Ша* и рестрикции ШР*.
а) НЬА DRB1*; в 3% агарозном геле после второго раунда ПЦР (дорожки вверху обозначены: аллели НЬА DRB1*, молекулярный вес);
б) VNTR IL-1aR*; в 6% полиакриламидном геле. Дорожки обозначены полученными генотипами (вверху обозначены аллели и маркер молекулярного веса ДНК плазмиды pBluscriptSKП гидролизованная эндонуклеазой рестрикции MspI). Праймеры: IRA1 CCCACTCATGGCCTTGTTC и IRA2 GGCTCAATGGGTACCACATC ;
в) ^-1Р*; в 8% полиакриламидном геле. Дорожки обозначены полученными генотипами, (вверху обозначены аллели и маркер молекулярного веса ДНК плазмиды pBluscriptSKП, гидролизованной эндонуклеазой рестрикции MspI). Праймеры: ^-1Р-и TCCCTACTGGTGTTGTCATCAG и ^-1Р -R CTTGGGTGGACATGGTCCTG.
ответствует биологическим и медицинским исследованиям [7].
Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины относительного риска (RR)r которую высчитывали по модифицированной формуле для малых выборок. Для RR рассчитывали доверительный интервал (С1) при 95% уровне значимости. Если RR был равен 1, то считали, что ассоциация отсутствует. Если RR был меньше 1, считали ассоциацию отрицательной; если RR был больше 2, то ассоциацию считали положительной [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При сопоставлении частот сочетаний аллелей НЬА DRB1* и 1ЬШа у женщин в сравниваемых группах обнаружены достоверно значимые различия по сочетанию аллеля НЬА DRB1*04 и аллеля IL1Rа*4Rr которое чаще встречалось у женщин исследуемой группы, чем в группе сравнения (27,3% против 13,0%; X2 = 4,22, р < 0,05) (рис. 2а). Относительный риск заболевания для этих сочетаний составил ^ = 2,43, С1 = 0,91-6,49; X2 = 5,22 (р < 0,05)).
35 -,
30-
25 -
20-
15 -
10-
5 -
о-
HLA DRB1 *04/ILl Ra*4R
Группа!
Группа II
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
HLA DRBl*04/ILlp*C
Группа!
Группа II
Рис. 2. Частота сочетания аллеля НЬА DRB1*04 с аллелем IL-1aR* 4R (а) и с аллелем ^-1Р* С (б) у женщин с физиологическим течением беременности и репродуктивной патологией.
Необходимо отметить, что ранее были обнаружены положительные ассоциации Н^ DRB1*04 с невынашиванием беременности [4]. По данным этих исследований относительный фактор риска не превышал 2,5 единиц, что сопоставимо с полученными нами результатами.
Сравнение распределения сочетаний аллелей Н^ DRB1* с генотипами 1ЬШа* у женщин с репродуктивными нарушениями и с физиологическим течением беременности показало отсутствие каких-либо статистически значимых различий между группами. Аналогичные результаты были получены при сравнении ча-
стот сочетаний генотипов Н^ DRB1* с генотипами 1ЬШа* у обследованных женщин.
При сопоставлении частот сочетаний спе-цифичностей Н^ DRB1* с 1ЫР* у женщин исследуемой группы и группы сравнения было обнаружено, что из вс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.