РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 259-266
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИЛ-18 И ИЛ-1р У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2009 г. А.Н. Силков, Е.П. Горева, А.С. Жовмер, Ф.Д. Киреев, В.Н. Максимов*, И.В. Пилипенко**, Е.А. Малиновская***, Н.Н. Бабышкина***, Н.В. Литвяков***, С.В. Сенников, В.А. Козлов
ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия;
*ГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск, Россия;
**Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия;
***ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск, Россия
Поступила: 05.11.2008. Принята: 04.08.2009
Интерлейкины и цитокины играют важную роль в патогенезе многих злокачественных новообразований. Некоторые из идентифицированных в генах цитокинов однонуклеотид-ных замен могут влиять на экспрессию или функцию цитокина, изменяя течение воспалительного процесса или предрасположенность к развитию новообразований. В настоящем исследовании изучена ассоциация между раком молочной железы и аллельными вариантами генов интерлейкина-ф и интерлейкина-18. При сравнительном анализе 299 больных с диагнозом рак молочной железы и 300 женщин контрольной группы не выявлено различий в распределении генотипов интерлейкина-ф, аллельные варианты (-607СС, —137СС и — 137СС) промотора гена ИЛ-18 статистически значимо чаще представлены у больных раком молочной железы.
Ключевые слова: !Ь-18, !Ь-ф, БЫР, рак молочной железы
ВВЕДЕНИЕ
Рак молочной железы — это наиболее частая форма рака среди женщин, которая, по данным Юнеско, является последние 10 лет ведущей причиной смерти среди женщин в 28 наиболее индустриально развитых странах. В связи с этим изучение механизмов развития и поиск факторов риска, приводящих к возникновению рака молочной железы, является актуальной задачей и ведется многими лабораториями мира. Гены семейства ИЛ-1 играют важную роль в регуляции механизмов опухолевого роста и противоопухолевого иммунитета, что послужило основанием для их рассмотрения в качестве генов кандидатов. ИЛ-ф и ИЛ-18 — это полифункциональные цитокины семейства ИЛ-1, участвующие в процессах злокачественной трансформации, роста опухоли, инвазии и метастазировании. Противоречивые сведения, полученные при
Адрес: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. E-mail: ici@online.nsk.su, ici@ksn.ru
исследовании связи аллельных вариантов генов этих цитокинов с опухолями различной локализации, в том числе и в случаях рака молочной железы, в различных популяциях свидетельствуют о необходимости их исследования в каждой конкретной популяции [1—4]. В настоящей работе проведен сравнительный анализ распределения частот аллель-ных вариантов генов ИЛ-1 в и ИЛ-18 у больных раком молочной железы (РМЖ) и здоровых женщин Западной Сибири.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследованные выборки
Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288), было получено разрешение локального комитета по биомедицинской этике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН.
В исследование включены 299 больных инфильтрирующим операбельным раком
Таблица 1. Последовательности и характеристики праймеров
ИЛ-1Р ( + 3954T/C) (F)5'-ctcaggtgtcctcgaagaaatcaaa-3' (R)5'-gcttttttgctgtgagtcccg-3' Та = 59°С, продукт 194 п.н.
ИЛ-1Р (-31C/T) (F)5'-agaagcttccaccaatactc-3' (R)5'-agcacctagttgtaaggaag-3' Та = 55°С, продукт 239 п.н.
ИЛ-18 (-607C/A) (C)5'- gttgcagaaagtgtaaaaattattac-3' (A)5'-gttgcagaaagtgtaaaaattattaa-3' (R)5'-caatatggtgtcaaaggatag-3' Та = 48,5°С, продукт 161 п.н.
ИЛ-18 (-137 G/C) (G)5'-ccccaacttttacggaagaaaag-3' (C)5'-ccccaacttttacggaagaaaac-3' (R)5'-aggagggcaaaatgcactgg-3' Та = 60°С, продукт 261 п.н.
hGADPH (F)5'-aggctggggctcatttgcagg-3' (R)5'-tagccaaattcgttgtcataccag-3' Та = 60°С, продукт 640 п.н.
Примечание: (F) — прямой праймер, (R) — обратный праймер, (С), (А) и (G) — аллель-специфические праймеры, Ta — температура отжига праймеров.
молочной железы стадии T1-4N0-3M0, получавших лечение в НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН в 1996 — 2006 годах. Средний возраст женщин на момент заболевания составил 51,5 лет (20 — 79 лет). У 110 женщин сохранен менструальный цикл, 188 находились в менопаузе. В качестве группы популяционного контроля была сформирована сопоставимая по возрасту выборка 300 женщин, жительниц Новосибирска, на основе данных банка ДНК НИИ терапии СО РАМН и ИЦиГ СО РАН.
Аллель-специфическая ПЦР и рестрикцион-най анализ
Образцы ДНК женщин больных РМЖ (n = 299) были получены в НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), практически здоровых женщин группы популяционного контроля (n = 300) в НИИ терапии СО РАМН (г. Новосибирск). Последовательности олигонуклео-тидных праймеров для ПЦР представленные в таблице 1, были опубликованы ранее [5 — 9]. Для точек ИЛ-ф( + 3954)C>T и ИЛ-ф(-31) С>Т использовался анализ с рестриктазами Taq I и Alu I (Сибэнзим, Россия), соответственно. Для точек ИЛ-18(-137)С>С и ИЛ-18(-607) C>A использовалась аллель-специфическая ПЦР.
ПЦР проводили в термоциклере PTC-200 (MJ Research) в следующем режиме: 3 минуты при 95 оС — начальная денатурация, следующие 35 циклов: 10 секунд денатурация при 95 оС, 15 секунд отжиг праймеров при температуре указанной в таблице 1, 20 секунд синтез при 72 оС. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 5нМ dNTP, 10 пМ каждого
из праймеров, 2ед Тад полимеразы в 1х буфере (Сибэнзим, Россия).
Гидролиз продуктов ПЦР проводили в буфере, поставляемом с рестриктазой в условиях, рекомендованных производителем фермента. Полноту рестрикции контролировали по сайтам внутреннего контроля. Электрофорез проводили в 2% агарозных и 5% акриламид-ных гелях.
ИЛ-1р(+3954)С/Г
Если в позиции +3954 гена ИЛ-1Р находился нуклеотид С, то в результате рестрикции из фрагмента ДНК размером 194 п.н. получались фрагменты ДНК размером 95, 85, 14п.н. Если же в позиции +3954 находился нуклеотид Т, то в результате рестрикции получали фрагменты 180 и 14 п.н. Появление фрагмента ДНК размером 14 п.н. связано с наличием сайта рестрикции в олигонуклеотидной последовательности одного из праймеров и является свидетельством прошедшей рестрикции.
ИЛ-1р(~31)С/Г
Если в позиции —31 находился нуклеотид С, то в результате рестрикции из фрагмента ДНК размером 239 п.н. получались фрагменты ДНК размером 6, 233 п.н. Если же в позиции — 31 находился нуклеотид Т, то в результате рестрикции получали фрагменты 6, 97, 136 п.н. Фрагмент размером 6 п.н. является индикатором полноты расщепления ДНК по сайту внутреннего контроля в одном из прай-меров.
Таблица 2. Распределение аллелей и генотипов ИЛ-ф и ИЛ-18 в выборках больных РМЖ и популяци-
онного контроля жительниц Сибирского региона
Ген (полиморфизм) Контроль Больные РМЖ Х2 OR (95%CI)
ИЛ-1 ß (-31T/C) Частота генотипа, % (численность) T/T 41,9 (124) 42,8 (125) 0,051 1,04 (0,75-1,44)
T/C 46,6 (138) 44,9 (131) 0,183 0,93 (0,67-1,29)
C/C 11,5 (34) 12,3 (36) 0,099 1,08 (0,66-1,79)
Частота аллеля T 0,652 0,652 0,000 1,00 (0,79-1,27)
C 0,348 0,348 1,00 (0,79-1,27)
n 296 292
ИЛ-1 ß ( + 3953C/T) Частота генотипа, % (численность) C/C 52,9 (154) 56,4 (167) 0,725 1,15 (0,83-1,59)
C/T 40,9 (119) 36,2 (107) 1,395 0,82 (0,59-1,14)
T/T 6,2 (18) 7,4 (22) 0,359 1,22 (0,64-2,32)
Частота аллеля C 0,734 0,745 0,193 1,06 (0,82-1,38)
T 0,266 0,255 0,94 (0,73-1,22)
n 291 296
ИЛ-18 (-137G/C) Частота генотипа, % (численность) G/G 39,2 (111) 48,3 (141) 4,797* 1,45 (1,04-2,01)
G/C 55,1 (156) 39,7 (116) 13,699*** 0,54 (0,39-0,75)
C/C 5,7 (16) 12 (35) 7,130** 2,27 (1,23-4,21)
Частота аллеля G 0,668 0,682 0,244 1,06 (0,83-1,36)
C 0,332 0,318 0,94 (0,73-1,20)
n 283 292
ИЛ-18 (-607C/A) Частота генотипа, % (численность) C/C 35,8 (105) 47,2 (125) 7,377** 1,60 (1,14-2,24)
C/A 54,3 (159) 47,2 (125) 2,804 0,75 (0,54-1,05)
A/A 9,9 (29) 5,6 (15) 3,440 0,34 (0,18-0,65)
Частота аллеля C 0,630 0,708 7,383** 1,42 (1,11-1,83)
A 0,370 0,292 0,70 (0,55-0,90)
n 293 265
Примечание: п — размер выборки; %2 — значение критерия хи-квадрат при сравнении частот генотипов и аллелей в выборках больных РМЖ и контрольной группы; р<0,05, р<0,01, р<0,001. OR — отношение шансов, 95% С1 — 95% доверительный интервал для отношения шансов.
ИЛ-18(-607)С/А и ИЛ-18(~1377)С/С
Если в позиции —607 промотора гена ИЛ-18 находился нуклеотид С или А, то в результате амплификации с соответствующей парой праймеров появлялся фрагмент ДНК размером 161 п.н. Если в позиции —137 промотора находился нуклеотид G или C, то в результате амплификации с соответствующей парой праймеров появлялся фрагмент ДНК размером 261 п.н. В качестве внутреннего контроля при проведении аллель специфической ПЦР использовали амплификацию фрагмента гена GADPH (ПЦР продукт 640 п.н.).
Детекцию фрагментов ДНК и анализ результатов электрофореза выполняли с помощью видеоденситометра и программного обеспечения «ImageMaster®VDS» (Pharmacia Biotech, USA).
Статистическая обработка
Для обработки данных о распределении аллельных вариантов генов интерлейкинов использовали стандартные статистические методы. Частоту аллелей и генотипов рассчитывали как процентное соотношение к общему числу исследованных аллелей или генотипов. Для определения статистически значимых различий в частоте встречаемости аллелей и генотипов в сравниваемых группах использовался критерий х2 , а также проводилась оценка отношения шансов (OR).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Полученные данные о распределении частот аллельных вариантов генов ИЛ-ф и ИЛ-18 в обследованных выборках женщин Сибирского региона представлены в таблице 2.
Статистически значимых отличий по частотам аллелей и генотипов исследованных ал-
Таблица 3. Частоты генотипов и аллелей полиморфизма -137С/С гена ИЛ-18 в выборках больных
РМЖ с лимфогенным метастазированием и без
Контроль Больные РМЖ X2 OR (95%С1)
Нет метастаз. Есть метастаз.
Частота генотипа, % (численность) С/С 39,5 (103) 51,8 (87) 42,1 (48) С6,290* ь0,230 С2,550 с1,648 (1,114-2,437) ь1,116 (0,713-1,744) С0,677 (0,419-1,094)
С/С 54,8 (143) 38,1 (64) 43,9 (50) С11,408** ь3,7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.