научная статья по теме ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧАЕМЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧАЕМЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 4, с. 389-394

== РАДИАЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА =

УДК 582.475.4:575.113.2:539.1.047

ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧАЕМЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ СОСНЫ

ОБЫКНОВЕННОЙ © 2015 г. Е. А. Казакова, П. Ю. Волкова, С. А. Гераськин*, Д. О. Помелова

Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии ФАНО, Обнинск

Исследован полиморфизм фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в популяциях сосны обыкновенной, населяющих участки Брянской области, загрязнённые радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС. Установлено, что с ростом мощности дозы хронического облучения (7.0—129.9 мГр/год) статистически значимо увеличивается общая частота мутаций. Не выявлено значимых изменений активности данного фермента от мощности дозы ионизирующего излучения.

Авария на ЧАЭС, сосна обыкновенная, изоферментный полиморфизм, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, хроническое облучение, активность ферментов.

БО1: 10.7868/80869803115040049

В результате крупных радиационных аварий на Южном Урале и в Чернобыле значительные площади лесных массивов были загрязнены радиоактивными выпадениями. Высокие уровни радиационного воздействия ведут к деградации лесных фитоценозов [1, 2], однако отдаленные последствия хронического низкодозового облучения остаются предметом научных дискуссий. Электрофоретические методы анализа белкового полиморфизма позволяют количественно оценить генетическую изменчивость и дифференциацию популяций, обитающих на контрастных по уровню радиационного воздействия территориях [3]. В сочетании с оценкой биохимической активности ферментов этот метод позволяет исследовать адаптивные процессы, идущие в хронически облучаемых популяциях на молекулярном и клеточном уровнях организации. Таким образом, изучение закономерностей формирования биологических эффектов и оценка изменений в генетической структуре популяций позволят получить дополнительную информацию об отдаленных последствиях хронического радиационного воздействия на популяции растений. Данная работа является продолжением серии экспериментов по анализу изоферментного полиморфизма и изменений генетической структуры популяций сосны обыкновенной в условиях многолетнего хронического облучения.

* Адресат для корреспонденции: 249032 Россия, Калужская обл., Обнинск, Киевское ш., 109 км, ФГБУН "Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии" ФАНО; тел.: +7 (48439) 6-48-02; факс: +7 (48439) 6-80-66; e-mail: stgeraskin@gmail.com.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Исследование проводили в популяциях сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на четырех участках в Брянской области, загрязненных радионуклидами в результате аварии на Чернобыльской АЭС (табл. 1). В качестве контроля были выбраны два участка, содержание радионуклидов в почве которых не превышало обычный для этого региона уровень. В отобранных на экспериментальных участках образцах почвы (2012 г.) определяли основные физико-химические характеристики, а также содержание тяжелых металлов как в почвенных пробах, так и в собранном биологическом материале (шишках). Поглощенную генеративными органами сосны дозу оценивали с помощью специально разработанной дозиметрической модели [4, 5]. Для параметризации этой модели на экспериментальных участках определяли содержание 137Cs в трех верхних слоях почвы (0—5, 5—10, 10—15 см), а также содержание 137Cs и 90Sr в шишках экспериментальных деревьев. Подробное описание объекта, района исследования, методов отбора и анализа проб, данные по техногенному загрязнению участков представлены в работе [5].

Электрофоретический анализ глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы выполняли по методике [6]. Фермент экстрагировали из эндоспермов семян сосны обыкновенной. Использовали только хорошо выполненные семена. Идентификацию ал-лозимов проводили по их относительной элек-трофоретической подвижности. Было проанализировано более 1000 локус-тестов (табл. 2).

Оценивали три типа мутаций, детектируемых на зимограмме: нуль-мутации, дупликации и из-

Таблица 1. Характеристика экспериментальных участков

Обозначение Расположение Средняя активность 137Cs в 0-15 см почвенном слое, Бк/кг Активность 137Cs в шишках, Бк/кг Активность 90Sr в шишках, Бк/кг Мощность поглощенной дозы, мГр/год

К Выгоничский район, с.ш. 53°1' в.д. 33°55' 52.1 30.0 ± 3.7 1.3 ± 0.06 0.14

К1 Унечский район, с.ш. 52°46' в.д. 32°39' 116.9 10.3 ± 2.1 1.1 ± 0.7 0.27

ВИУА Новозыбковский район, с.ш. 52°29' в.д. 31°50' 2436.0* 948 ± 13* 16.8 ± 1.9 7.00

СБ Клинцовский район, с.ш. 52°33' в.д. 31°44' 10212.7* 342 ± 8* 20.8 ± 1.3 22.9

ЗП Красногорский район, с.ш. 53°5' в.д. 31°42' 36160.0* 1008 ± 18* 64.2 ± 2.2 91.4

ЗК Красногорский район, с.ш. 53°5' в.д. 31°42' 56333.3* 3246 ± 32* 83.0 ± 2.2 129.9

* Различия значимы по сравнению с контролем (К),р < 0.05.

менения электрофоретической подвижности. В качестве показателей, описывающих генетическую структуру исследуемых популяций, использовали частоту редких аллелей, индекс Животов-ского и эффективное число аллелей. Доля редких аллелей позволяет детализировать изофермент-ную структуру популяции и оценить, как изменяется частота встречаемости редких аллелей в популяциях, индекс Животовского интерпретируется как среднее число генотипов в выборке, а эффективное число аллелей представляет собой сумму аллелей данного локуса с учетом частоты встречаемости каждого из них.

Активность фермента оценивали в соответствии с рекомендациями Х. Биссвангера [7] на бескюветном спектрофотометре "NanoDrop-2000" ("Thermo", США). Подробности проведения изоферментного анализа, анализа активности ферментов и статистической обработки результатов описаны ранее [8, 9]. Расчеты проводили с помощью пакетов Microsoft Office Excel 2007

Фермент G6PD

Локус g6pd-1 g6pd-2

Аллель 0.98 1.00 1.05 n 0.95 1.00 1.10 n

Рис. 1. Схематическое обозначение аллозимов двух локусов G6PD.

и 81а1АзИса 6.0, графики созданы в программе шар1о1 11.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследуемых популяциях сосны обыкновенной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа представлена продуктами двух различающихся по электрофоретической подвижности локусов. Исключение составляют два наиболее загрязненных участка, где у фермента был идентифицирован только один полиморфный локус. На всех исследуемых участках локусы представлены тремя аллелями (рис. 1), наиболее часто встречающийся аллель локуса обозначали как 1.00.

На основании полученных данных была оценена частота каждого аллеля в контрольных и экспериментальных популяциях (табл. 2). Выявлено, что в условиях хронического облучения повышается частота редких аллелей (табл. 2). Общая частота мутаций (рис. 2) растет вместе с мощностью поглощенной дозы на участках и значимо превышает контрольные показатели для наиболее загрязненного участка (ЗК). Основной вклад в общее число мутаций вносят нуль-мутации.

Для сравнения генотипического разнообразия популяций использовали индекс Животовского (ц). Локусы g6pd-1 и g6pd-2 во всех популяциях характеризуются средним уровнем изменчивости (1< ц < 3) (табл. 3). Для детализации аллозимной структуры популяций оценили долю редких аллелей (Нц), отражающую соотношение между частотами наиболее редко и наиболее часто встречающихся в выборке фенотипов. Статистически значимой корреляции доли редких аллелей и эффективного числа аллелей (пе) с мощностью по-

ПОЛИМОРФИЗМ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 391

Таблица 2. Частоты аллелей двух локусов G6PD в экспериментальных популяциях

Участок Локус Число проведенных локус-тестов Аллель Частота

Контроль старый (К) g6pd-1 46 0.98 1 1.05 п 0.043 ± 0.030 0.956 ± 0.030 0 + 0.005 0

g6pd-2 146 0.95 1 1.1 п 0.089 ± 0.023 0.842 ± 0.030 0.062 ± 0.020 0.007 ± 0.007

Контроль новый (К1) g6pd-1 91 0.98 1 1.05 п 0.055 ± 0.024 0.934 ± 0.026 0 + 0.005 0.011 ± 0.011

g6pd-2 113 0.95 1 1.1 п 0.062 ± 0.023 0.903 ± 0.028 0.035 ± 0.017 0

ВИУА g6pd-1 167 0.98 1 1.05 п 0.024 ± 0.012 0.928 ± 0.020 0.048 ± 0.016 0

g6pd-2 170 0.95 1 1.1 п 0.012 ± 0.008 0.953 ± 0.016 0.029 ± 0.013 0.006 ± 0.006

Старые Бобовичи g6pd-1 70 0.98 1 1.05 п 0.086 ± 0.033 0.886 ± 0.038 0.028 ± 0.020 0

g6pd-2 104 0.95 1 1.1 п 0.144 ± 0.034 0.788 ± 0.040 0.038 ± 0.019 0.029 ± 0.016

Заборье Поле (ЗП) g6pd-2 41 0.95 1 1.1 п 0 + 0.023 0.976 ± 0.024 0 + 0.023 0.024 ± 0 .024

Заборье Кладбище (ЗК) g6pd-2 89 0.95 1 1.1 п 0.101 ± 0.032 0.685 ± 0.049 0.146 ±0 .037 0.067 ± 0.027*тт

Примечания. п — нуль-аллель, отсутствие окрашенной зоны на геле. Для п указана частота появления в эндоспермах; малый объем выборки в популяциях ЗП и ЗК связан с особенностями пробоотбора в 2012 г. Показатели значимости различий от контроля приведены только для нуль-аллеля.

* Различия значимы по сравнению с контролем старым (К), р = 0.014. тт Различия значимы по сравнению с контролем новым (К1), р = 0.006.

0.12 г

0.14 0.27 7.00 22.90 91.40 129.90 Мощность дозы, мГр/год

Рис. 2. Общая частота мутаций в эндоспермах семян сосны обыкновенной по двум локусам глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

* Различия значимы по сравнению с контролем старым (К), р = 0.019.

т Различия значимы по сравнению с контролем новым (К1), р = 0.017.

М

а т н е

м р

е

ть

с о н в и т

0.14 г

0.12

0.10

0.08

0.06

0.04

^ 0.02

0.14 0.27 7.00 22.90 91.40 129.90 Мощность дозы, мГр/год

Рис. 3. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в популяциях сосны обыкновенной, развивающихся в условиях хронического радиационного воздействия.

0

глощенной дозы не обнаружено (г = —0.16, г = — 0.51, соответственно).

Значимых изменений в активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы между контрольными и экспериментальными популяциями не выявлено (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Важную роль в ответной реакции клетки на стресс играют соединения- и ферменты-антиок-сиданты. Цитозольный фермент глюкозо-6-фос-

фатдегидрогеназа (G6PD) отвечает за образование в клетке НАДФН, участвующего в системе антиоксидантной защиты клетки, тем самым играя важную роль в элиминации активных форм кислорода.

Методом вертикального электрофореза в по-лиакриламидном геле выявлены две зоны активности G

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком