ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ =
УДК 597.442-115+591.473:543.545
ПОЛИМОРФИЗМ ЛОКУСА МИОГЕНОВ У НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ОСЕТРОВЫХ (Acipenseridae) © 2014 г. Е. В. Кузьмин, О. Ю. Кузьмина
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина Российской академии наук, пос. Борок, Ярославская область 152742 e-mail: kuzmev@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 12.11.2013 г. Окончательный вариант получен 21.03.2014 г.
Методом электрофореза в полиакриламидном геле изучались мышечные белки русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt), сибирского осетра (Acipenser baerii Brandt) и амурского осетра (Acipenser schrenckii Brandt). Среди общего пула белков была выявлена группа фракций, предположительно являющаяся продуктом полиаллельного локуса MY-1*. Результаты денситометрического анализа позволили выдвинуть гипотезу о восьмигенной детерминации данной системы белков. Наибольшая степень гетерогенности и полиморфизма выявлена у русского осетра. Анализ распределений генотипов в выборках исследованных видов позволил высказать предположение, что генетическая структура идущих на нерест стад осетровых претерпела изменения под влиянием антропогенных и природных факторов.
DOI: 10.7868/S0016675814090070
В настоящее время из-за резкого уменьшения общей численности осетровых значительно сократились возможности проведения популяци-онно-генетических исследований их природных популяций с использованием белков в качестве биохимических маркеров. Трудности с получением образцов являются одной из причин, по которой исследователи все шире стали использовать в качестве маркеров фрагменты ДНК, так как для решения ряда задач ДНК-методы позволяют ограничиться небольшими по размерам выборками. По сравнению с биохимическими, ДНК-маркеры обладают рядом преимуществ [1]. Однако применительно к осетровым у них имеется существенный недостаток: база данных по этим маркерам находится на стадии становления и накопления первичного материала, в то время как для использования популяционно-генетических данных в научно-исследовательских и прикладных целях необходимо иметь достаточно полное представление о полиморфизме используемых локу-сов, а также о популяционно-генетической структуре видов в разных частях ареала и трендах изменения этой структуры [2].
В работах, где ДНК-маркеры используются для изучения популяций видов, рассматриваемых в данной статье, констатируется, что в естественных условиях у них наблюдается достаточно высокий уровень генетического разнообразия. Однако для подробных сравнительных исследований имеющихся данных пока явно недостаточно. Показано лишь, что каспийская популяция рус-
ского осетра имеет наибольшее аллельное разнообразие по всем микросателлитным локусам как по сравнению с азовской и черноморской популяциями этого вида, так и по сравнению с сибирским осетром [3—9].
Исследование белкового полиморфизма осетровых проводится с середины 60-х годов прошлого века. За этот период был собран обширный массив данных о гетерогенности, полиморфизме и генетической детерминации целого ряда биохимических маркеров. Кроме того, подробно описана популяционно-генетическая структура видов семейства Аарешейёае в разное время в разных частях их ареалов. По этой причине биохимические маркеры не теряют своей актуальности и до настоящего времени и широко используются как в прикладных [10—14], так и в академических исследованиях [15—19].
Проанализированная в настоящей работе группа фракций впервые была выявлена при изучении общей гетерогенности мышечных белков осетровых [20]. Однако в этом исследовании не ставилась задача поиска генетических маркеров, и лишь позднее, при изучении фенотипической изменчивости мышечных белков, было высказано предположение, что данные фракции являются проявлением генетически детерминированного аллелизма [21].
Расширение круга известных биохимических маркеров может оказаться полезным при проведении мер по восстановлению численности и сохранению генетического разнообразия осетро-
6
1089
вых, а также при мониторинге биоразнообразия маточных стад на рыбоводных заводах. Кроме того, дополнительные данные о числе аллелей у отдельных индивидуумов могут быть использованы для уточнения уровня плоидности осетровых [22].
Цель настоящего исследования — проанализировать имеющуюся в нашем распоряжении коллекцию мышечных протеинограмм трех видов осетровых, собранную в период, когда их природные популяции имели еще достаточно высокую численность, изучить гетерогенность и полиморфизм системы мышечных белков, возможно генетически детерминированной и способной служить в качестве биохимического маркера.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования стали представители семейства Acipenseridae, для которых у нас имеются достаточно репрезентативные выборки: русский осетр Acipensergueldenstaedtii Brandt (р. Волга: 1983, 1984, 1986, 1988, 1989, 1992, 1993 гг., n = = 216); сибирский осетр Acipenser baerii Brandt (Обская губа: 1983 г., n = 156; р. Лена: 1982 г., n = = 88); амурский осетр Acipenser schrenckii Brandt (Амурский лиман: 1983 г., n = 24). Пробы отбирались у разновозрастных рыб разных генераций во время нерестовой миграции либо непосредственно в реках (Волга, Лена), либо в устьях рек (Обь, Амур). В настоящее время все эти виды занесены в "Красную книгу МСОП" [23].
Фракционирование саркоплазматических мышечных белков (миогенов) проводили методом диск-электрофореза в блоках 7%-ного полиакри-ламидного геля. Способы отбора, хранения и подготовки проб, а также особенности проведения электрофореза подробно описаны ранее [20]. После фракционирования и окрашивания белков гелевые блоки высушивались [24] и в таком виде хранились до момента проведения денситометри-ческого анализа. Для визуализации белков использовали краситель Кумасси R-250. Сканирование гелей осуществляли на денситометре MD 100 ("Carl Zeiss", Jena), спектральный диапазон измерительного света которого составлял 590— 720 нм.
На полученных денситограммах выявлялись пики, соответствующие фракциям интересующей нас белковой системы. При используемых условиях фракционирования, окрашивания и денситометрирования площади пиков соответствуют интенсивности проявления фракций на протеинограммах [25—29].
Считая, что степень выраженности полос в спектрах определяется дозой соответствующих генов в геноме, на основании оценки соотношения интенсивности окрашивания фракций рыбы со сходными характеристиками объединяли в
группы, предположительно имеющие одинаковые наборы генов.
Денситометрированию подвергались только те генотипы, которые были выявлены не менее чем у шести рыб, так как мы посчитали, что при наблюдаемом уровне варьирования признака выборки меньшего размера имеют неприемлемую репрезентативность. При расчетах соотношения интенсивности окрашивания фракций площадь пика, соответствующего наименее окрашенной полосе, принималась за единицу. С этой площадью сравнивались площади остальных пиков. Для полученных статистических рядов определялись средние значения признака (X) и доверительные интервалы х) для 5%-ного уровня значимости
[30].
Фракции, фенотипы, аллели и генотипы обозначали в соответствии с рекомендациями по стандартизации генетической номенклатуры в работах, посвященных биохимической генетике рыб
[31]. При записи генотипов перед буквенным обозначением аллельных вариантов ставился коэффициент, показывающий дозу гена, определяющего синтез данного типа молекул в общем пуле.
Частоты аллелей определялись на основании анализа обнаруженных в выборках генотипов. С использованием данных о фактических частотах вычислялись теоретически ожидаемые численности генотипов при условии свободной и независимой рекомбинации выявленных аллелей. В случае восьмигенной детерминации изучаемой белковой системы и наличия пяти аллелей у русского осетра теоретические частоты генотипов у него должны соответствовать распределению (р*а + р*Ь + р*с + р*й + р*е)8. Аналогично вычислялись теоретические частоты генотипов и двух других видов. Генотипы, представленные одинаковыми наборами аллелей, по-разному распределенными между хромосомами, объединялись в одну группу, так как с помощью используемого нами метода электрофореза не представляется возможным осуществить точную привязку гена к той или иной хромосоме.
Оценку отклонений фактических частот генотипов от теоретически ожидаемых в соответствии с распределением Харди—Вайнберга производили при помощи стандартного критерия х2. Для этого использовали метод последовательного сведения многоаллельной ситуации к двухаллель-ной: проверяемый аллель (а) — сумма всех остальных аллелей с последующим суммированием значений критериев, полученных для каждого аллельного варианта, и сравнением интегрального значения с критическим для соответствующего суммарного числа степеней свободы [32, 33].
Таблица 1. Теоретически ожидаемые и фактические соотношения интенсивности окрашивания фракций локуса МУ-1* в наиболее часто встречающихся гетерогенных генотипах
Соотношения интенсивности окрашивания фракций
Фенотип № Генотип n
теоретические фактические
Русский осетр (р. Волга)
АВ 1 5a/3b 25 1.7 1 (1.72 ± 0.08) : 1
АС 2 4a/4c 6 1 1 (1.10 ± 0.13) : (1.03 ± 0.05)
ABC 3 3a/3b/2c 42 1.5 1.5 : 1 (1.63 ± 0.07) : (1.67 ± 0.06) : 1
ABC 4 2a/4b/2c 20 1 2 : 1 (1.17 ± 0.04) : (1.73 ± 0.11) : 1
ABC 5 4a/3b/1c 21 4 3 : 1 (3.71 ± 0.25) : (2.50 ± 0.16) : 1
ABCD 6 2a/2b/2c/2d 7 1 : 1 : 1 : 1 (1.19 ± 0.17) : (1.24 ± 0.18) : (1.17 ± 0.16) : 1
ABCDE 7 1a/2b/2c/2d/1e 13 1 2 : 2 : 2 : 1 (1.12 ± 0.08) : (2.00 ± 0.20) : (2.03 ± 0.17) : (1.80 ± 0.19) (1.05 ± 0.05)
ABCDE 8 2a/2b/2c/1d/1e 22 2 2 : 2 : 1 : 1 (1.94 ± 0.17) : (1.85 ± 0.17) : (1.95 ± 0.12) : (1.14 ± 0.06) (1.05 ± 0.04)
Сибирский осетр (р. Обь)
ABC 1 3a/3b/2c 65 1.5 1.5 : 1 (1.67 ± 0.08) (1.49 ± 0.06) : 1
ABC 2 3a/2b/3c 29 1.5 : 1 : 1.5 (1.69 ± 0.10) 1 : (1.44 ± 0.08)
ABC 3 4a/2b/2c 30 2 1 : 1 (2.08 ± 0.14) (1.03 ± 0.02) : (1.05 ± 0.03)
ACE 4 3a/3c/2e 11 1.5 : 1.5 : 1 (1.76 ± 0.29) (1.77 ± 0.30) : 1
ACE 5 2a/4c/2e 6 1 2 : 1 (1.07 ± 0.08) (1.57 ± 0.39) : (1.03 ± 0.08)
Сибирский ос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.