ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 5, с. 652-658
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:597.554.3
ПОЛИМОРФИЗМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ У ПОРОД ДОМАШНЕГО КАРПА (Cyprinus carpió L.) ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ
© 2010 г. Р. И. Луданный1*, Г. Г. Хрисанфова1*, В. К. Призенко2, А. К. Богерук2, С. К. Семенова1
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: seraphimas@mail.ru 2ООО "Акватехнопарк", Москва 103001 Поступила в редакцию 03.04.2009 г.
С помощью пяти микросателлитных локусов проведено генотипирование и получены оценки генетического разнообразия для девяти выборок, представляющих семь наиболее распространенных на территории России пород карпа. Для сравнения использованы образцы амурского сазана (Cyprinus carpió haematopterus) и выборка венгерского карпа европейской селекции. В 11 исследованных выборках (n = 148) обнаружено 78 аллелей. Наибольшее среднее число аллелей на локус характерно для амурского сазана (7.3), а наименьшее — для черепетских карпов (4.0). Значения наблюдаемой ге-терозиготности Но варьировали у разных пород от 0.819 (алтайский чумышский карп) до 0.651 (че-репетский чешуйчатый карп). Три локуса из пяти (MFW-24, MFW-28и MFW-19) позволяют детектировать высокий уровень популяционной дифференциации. На дендрограмме генетических различий все породы объединились в две группы, одну из которых составляют две линии ропшинского карпа, ставропольский карп и амурский сазан, а также две выборки черепетского карпа. В состав второго кластера вошли алтайский зеркальный карп (приобская и чумышская популяции), две породы ангелинского карпа (зеркальный и чешуйчатый) и венгерский карп. Дифференцированы также пары пород/популяций/линий, имеющих общее происхождение, а именно две популяции алтайского карпа, две линии ропшинских карпов, а также породы ангелинских и черепетских карпов. Обсуждаются причины дифференциации пород карпа отечественной селекции и соответствие истории происхождения этих пород, одни из которых произошли от карпа европейской селекции, а другие содержат значительную примесь амурского сазана.
Микросателлиты (МКС) составляют одну из наиболее вариабельных высокополиморфных групп повторяющихся последовательностей генома эукариот и поэтому широко применяются в популяционной и эволюционной биологии, для генного картирования и анализа родословных [1, 2]. Среди карповых первые МКС были выделены из генома полосатого данио, а затем использованы для построения первой генетической карты рыб [3].
Сазан и его одомашненная форма, домашний карп Cyprinus carpió (подсем. Cyprininae, сем. Cyp-rinidae), издавна составляют излюбленный объект прудового рыбоводства во многих странах мира. В современной мировой аквакультуре домашний карп представлен большим числом пород, отводков и морф, различающихся по размеру, окраске (например, орнаментальные формы карпа кои) и чешуйчатому покрову (например, зеркальные, чешуйчатые, "голые" карпы). Полагают, что этот вид образовался в Юго-Восточной Азии в среднем миоцене [4]. Предками современного домашнего карпа, вероятно, послужили ази-
* Оба автора внесли равный вклад в данное исследование.
атские сазаны, завезенные в Европу примерно в VII в. до н.э. Несмотря на широкое распространение сазана, большинство исследователей признают значимыми только различия между двумя его подвидами: европейским сазаном (C. c. carpió), обитающим в западной части Европы, и азиатским, или амурским, сазаном С. с. haematopterus, обитающим на Дальнем Востоке и странах Юго-Восточной Азии [5].
В течение последних 10—15 лет интенсивно изучается генетическое и геномное разнообразие пород карпа зарубежной селекции с целью картирования генов продуктивности и устойчивости к различным заболеваниям, изменениям окружающей среды, а также для создания новых высокопродуктивных пород и линий [6]. В настоящее время охарактеризованы МКС карпов, разводимых в странах Юго-Восточной Азии и Центральной и Западной Европы [7—16]. Многие из указанных МКС использованы не только для дифференциации пород, линий, отводков, кроссов и разновидностей домашнего карпа, но и для выявления внутривидовой изменчивости разных видов карповых рыб [17, 18]. С этой точки зрения молекулярно-генетическая изменчивость более
Таблица 1. Размер выборок, возрастной состав и характеристики полиморфизма по пяти микросателлитным ло-кусам исследованных пород, популяций и линий карпа и амурского сазана
Порода (популяция, линия) Обозначение пород N (возраст) A He/Ho P ^is
Алтайский карп (чешуйчатый) Al_1 12 (2+) 7.2 0.819/0.595 0.001 0.284
Алтайский карп (зеркальный) Al_2 11 (2+) 4.4 0.656/0.615 0.12* 0.065
Ангелинский карп (чешуйчатый) An_1 10 (3+) 5.0 0.716/0.747 0.136* -0.046
Ангелинский карп (зеркальный) An_2 9 (5+) 5.8 0.767/0.880 0.008 -0.157
Венгерский карп Hu 15(0+) 5.2 0.658/0.741 0.007 -0.13
Амурский сазан As 15(0+) 7.3 0.713/0.593 0.025 0.175
Ставропольский карп St 20 (4+) 6.4 0.783/0.760 0.114* 0.032
Ропшинский карп (линия ММ) R(MM) 15(1+) 5.8 0.783/0.743 0.130* 0.057
Ропшинский карп (линия ВВ) R(BB) 15(0+) 5.0 0.750/0.695 0.024 0.079
Черепетский карп рамчатый Tch_1 13 (0+) 4.0 0.780/0.835 0.039 -0.102
Черепетский карп чешуйчатый Tch_2 13 (0+) 4.0 0.651/0.750 0.017 -0.164
£ 148 5.7 0.746/0.722 0.035
Примечание. N — число исследованных особей; А — среднее число аллелей/локус; Не — ожидаемая гетерозиготность; Но — наблюдаемая гетерозиготность; р — вероятность равновесного (Харди—Вайнберг) состояния, рассчитанная с поправкой Бон-феррони (звездочкой обозначены выборки с отсутствием равновесия); — индекс инбридинга.
двух десятков отечественных пород и линий карпа остается до сих пор слабоизученной. В настоящей работе приводятся результаты генотипиро-вания с помощью микросателлитных маркеров нескольких наиболее распространенных на территории России пород карпа. Для сравнения использованы образцы амурского сазана (С. с. кав-matopterus) и выборка венгерского карпа европейской селекции. Для этих групп ранее нами с помощью RAPD-маркеров получены оценки генетического разнообразия и проведена дифференциация пород [19].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы венозной крови были собраны у 148 особей из популяции амурского сазана (С. с. кав-matopterus) (Аз) и восьми пород карпа: ангелин-ский чешуйчатый (Ап_1), ангелинский зеркальный (Ап_2), венгерский (Ни), две линии ропшин-ского карпа R (линии ВВ и ММ), черепетский чешуйчатый (ТеИ_2), черепетский рамчатый (ТеИ_1), ставропольский (81), две популяции алтайского зеркального (приобская А1_2, чумыш-ская А1_1) карпа. Сведения о численности выборок и возрасте исследуемых рыб представлены в табл. 1. Некоторые известные селекционные и ге-
нетико-биохимические характеристики изученных пород даны нами ранее при описании RAPD-изменчивости [19].
Кровь консервировали в 0.05 М растворе ЭДТА (рН 8.0) и хранили при +4°С. Выделение тотальной ДНК проводили с помощью стандартного фенол-хлороформного метода. Состав реакционных смесей, условия амплификации, электро-форетического разделения и визуализации ПЦР-продуктов полностью соответствуют оригинальной публикации [7]. Реакцию амплификации проводили в термоциклере "MJ Research" (USA). Использовали ранее предложенные для дифференциации нескольких выборок европейского карпа пять пар праймеров (MFW-10, 19, 24, 26, 28), подобранных для МКС карпа и содержащих динуклеотидные повторы (СА)И [7]. В каждом из 35 циклов денатурацию ДНК-матрицы проводили при 94°С (30 с), отжиг праймеров — при 55°С в течение 30 с, элонгацию — при 72°С (2 мин). Окончательная достройка амплифицированных фрагментов производилась при 72°С в течение 10 мин. Реакционная смесь (10 или 25 мкл) содержала 63.4 мМ трис-HCl, 16.7 мМ (NH4)2SO4, 0.01% твин-20, 1.4 мМ MgCl2, 100 мкМ каждого dNTP, до 1.0—1.5 pmol каждого из праймеров, 0.6 е.а.
654
ЛУДАННЫЙ и др.
Таблица 2. Характеристика полиморфизма пяти микросателлитных локусов в суммарной выборке карпа и амурского сазана
Локус L N A AР He/Ho Fis Fst
MFW-24 180-244 108 21 1.0 0.8735/0.7345 0.160 0.151
MFW-19 120-214 113 16 1.0 0.9015/0.5545 0.386 0.231
MFW-26 98-161 109 14 1.0 0.8894/0.8583 0.035 0.055
MFW-10 118-150 123 14 1.0 0.7590/0.8307 -0.095 0.091
MFW-28 269-322 110 13 1.0 0.8407/0.5693 0.324 0.154
£ 98-322 130 78 (15.6*) 1.0 0.8528/0.7095 0.169 0.178
Примечание. Ь — размер аллелей, пн; N — размер выборки; А — число аллелей; Ар — доля полиморфных аллелей; Не — ожидаемая гетерозиготность; Но — наблюдаемая гетерозиготность; — индекс инбридинга; ^ — индекс подразделенности или дифференциации; * — среднее число аллелей на локус, рассчитанное для суммарной выборки по пяти локусам.
Taq-полимеразы ("Dialat", Москва) и 10—100 нг тотальной ДНК.
Разделение ПЦР-продуктов проводили в денатурирующем 6%-ном ПААГ согласно оригинальной публикации [7]. Визуализацию результатов электрофореза проводили серебрением с использованием набора SILVER SEQUENCE™ DNA ("Promega", USA) согласно рекомендациям производителя. Для выравнивания изображений на геле и определения размера (L) аллельных вариантов МКС использовали пакет программ GelCompare II ("Applied Maths NV", USA).
Для оценки полиморфизма МКС в отдельных выборках рассчитывали число аллелей (А), долю полиморфных аллелей (Ар), наблюдаемую (Но) и ожидаемую (Не) гетерозиготность, вероятность отклонения от равновесного состояния Харди-Вайнберга (р), а также два индекса, отражающих уровень инбридинга особей в отдельных популяциях (Fis) и индекс подразделенности или дифференциации выборок (Fst) [20]. Дендрограмму генетических различий на основании различий в аллельных частотах МКС [21] между отдельными выборками конструировали с использованием POPULATIONS (ver. 1.2.30) [22], визуализировали -при помощи Treeview (ver. 1.40).
РЕЗУЛЬТАТЫ
При генотипировании 11 выборок карпа и сазана по пяти микросателлитным локусам обнаружено 78 аллелей, размер которых изменялся в пределах 98-322 пн (табл. 2). Все изученные локу-сы оказались полиморфными (Р = 100%), а среднее число аллелей на локус составило 15.6 (табл. 2). В суммарной выборке максимальное число аллелей
(21) обнаружено по локусу М^Ж-24, а минимальное (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.