МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 592-601
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 575.17
ПОЛИМОРФИЗМ НЕКОДИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ТРЕХ ПОПУЛЯЦИЙ КАЗАХОВ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА РАЗЛИЧНЫХ ТЕРРИТОРИЯХ КАЗАХСТАНА, И ОБРАЗЦОВ ДНК ДРЕВНИХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КАЗАХСТАНСКОГО АЛТАЯ
© 2004 г. Н. А. Айтхожина*, Н. В. Дзисшк, Е. К. Людвикова
Институт молекулярной биологии и биохимии им М.А. Айтхожина Министерства образования и науки
Республики Казахстан, Алматы, 480012 Поступила в редакцию 20.08.2003 г.
Поступила после доработки 03.02.2004 г.
Исследован полиморфизм участка мтДНК главной некодирующей области (D-петли мтДНК) общей протяженностью 528 п.н. в трех выборках современных популяций казахов (алматинской, семипалатинской и алтайской), а также образцов ДНК древних людей, проживавших на современной территории Казахстанского Алтая. Использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ПДРФ-анализ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) по тринадцати сайтам рестрикции BamHI, EcoRV, Sau3AI (1 сайт рестрикции), KpnI (2 сайта), HaelII (3 сайта), RsaI (5 сайтов рестрикции). Определены распределения частот каждого сайта, рассчитаны показатели генного разнообразия h, значения генетических расстояний между различными популяциями казахов и другими популяциями мира. По аналогии с современными образцами проводили ПДРФ-анализ контрольного региона мтДНК ископаемых образцов. Два исследуемых образца митохондриальной ДНК из кургана 11 по всем анализируемым сайтам рестрикции были мономорфны.
Ключевые слова: человек, популяция, митохондриальная ДНК, некодирующая область митохонд-риального генома, рестрикционный полиморфизм.
POLYMORPHISM OF MITOCHONDRIAL GENOME NONCODING REGIONS IN THE THREE KAZAKH POPULATIONS INHABITED DIFFERENT AREAS OF KAZAKHSTAN AND IN THE SAMPLES OF DNA FROM ANCIENT PEOPLE OF KAZAKHSTAN ALTAI, by N. A. Aytkhozhina*, N. V. Dzisuk, E. K. Ludvikova (Ajtkhozhin Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Ministry of Education and Science, Almaty, 480012 Kazakhstan; *e-mail: aytkhozhina@mail.ru). Polymorphism of major noncoding region of mitochondrial DNA (mtDNA D-loop, 528 bp in length) from the three modern kazakh populations and from DNA samples of ancient people inhabited modern Kazakhstani Altai were studied. PCR and RFLP analysis of 13 sites of restriction - BamHI, EcoRV, Sau3AI (1 restriction site), KpnI (2 sites), HaeIII (3 sites), RsaI (5 restriction sites), were carried out. The distribution of each site frequencies was determined. Nucleotide diversity (h) and genetic distance between different kazakh population and other populations of world were estimated. The same RFLP analysis of the mitochondrial DNA control region was carried out for the paleogenomic samples. It was shown that two samples of ancient mitochondrial DNA were monomorphous throughout all analyzed restriction sites.
Полиморфизм митохондриальной ДНК (мтДНК) человека часто используют для восстановления истории его популяции [1]. При этом важно, что митохондриальный геном наследуется по материнской линии, в нем отсутствуют рекомбинаци-онные события, а скорость точечных мутаций, как минимум, на порядок больше, чем у ядерной ДНК [2]. Это позволяет вычленять расо- и попу-ляционно-специфические полиморфные сайты [3]. Объем собранных к настоящему времени данных о полиморфизме мтДНК в популяциях народов
* Эл. почта: aytkhozhina@mail.ru
мира позволяет на новом уровне решать популя-ционно-генетические проблемы, выходя за рамки простого накопления информации [4]. Привлечение исторических, антропологических и археологических сведений дает возможность уточнить вероятность тех или иных предположений об этногенезе и этнической истории изучаемого региона, включая и определение путей как древних, так и относительно недавних миграций, а также судить о популяционной динамике в прошлом.
В 1998-2000 гг. международная экспедиция Института археологии им. А.Х. Маргулана МОН
РК, при участии ряда академических научных учреждений, иод руководством З.С. Самашева проводила исследования курганов ранних кочевников на территории Казахстанского Алтая в пределах административной границы Катонкарагайского района Восточно-Казахстанской области Республики Казахстан. Если культурная принадлежность исследуемых памятников определена с большей долей вероятности как "пазырыкская", то их этническая атрибуция остается неизученной [5].
На территории Казахстана некрополь Берел является единственным памятником, исследование которого позволит с наибольшей достоверностью реконструировать облик представителей скифо-сакских племен, живших 2.5 тыс. лет назад. Материальная культура этих племен по художественным достоинствам и ценности относится к разряду редчайших археологических открытий степной цивилизации.
В настоящей работе приведены результаты по изучению рестрикционного полиморфизма неко-дирующей области мтДНК в трех современных популяциях казахов и ДНК древних людей, населявших территорию Казахстанского Алтая.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов периферической крови индивидов трех популяций казахов - алматинской, семипалатинской (казахи, проживающие в поселке Кайнар Семипалатинской области) и алтайской, включающей лиц, проживающих в пос. Берел вблизи от раскопок (Горный Алтай, Восточно-Казахстанская область). Все индивиды - казахи по происхождению и не родственники по материнской линии, как минимум, в двух поколениях. Ископаемую ДНК выделяли из костей мумифицированных останков людей, обнаруженных в курганах № 11 и № 25 могильника Берел, 1У-Ш вв. до н.э., всего четыре образца.
ДНК выделяли из клеток периферической крови по общепринятому методу [6], а в случае выделения ДНК из костей мумифицированных останков людей использовали тот же метод с некоторыми модификациями [7]. Одной из задач данной работы являлось получение качественного образца древней ДНК, который был бы пригоден для молекулярно-генетических исследований. Выделенная из пяточных костей мумифицированных людей ДНК содержала примеси, которые ингибировали работу полимеразы, что потребовало ее дополнительной очистки. Препараты ДНК фракционировали в агарозном геле с последующей элюцией из агарозы. Оценку качества полученной ДНК проводили с помощью электро-
фореза в 1 %-ном агарозном геле, приготовленном на ТАЕ-буфере.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для амплификации участков мтДНК использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: 15997 5'-CAC-CATTAGCACCCAAAGCT-3'; 16081 5'-ACCGCTAT-GTATTTCGTACA-3'; 16106 5'-GCCAGCCACCAT-GAATATTG-3'; 16254 5'-GCAGTTGATGTGTGAT-AGTT-3'; 16401 5'-TGATTTCACGGAGCATGGTG-3'; 16525 5'-AACGTGTGGGCTATTTAGGC-3'. Реакционная смесь содержала стандартный буфер, 0.1 мкг геномной ДНК, по 2 пмоля каждого из праймеров и смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), по 200 мкМ каждого. После начальной денатурации ДНК при 95 °С в течение 5 мин добавляли 1 ед. рекомбинантной ДНК-полимеразы "Biotag". Проводили 33 цикла амплификации в стандартных условиях, температура отжига праймеров -55°С.
Условия подбирали так, чтобы длина амплифи-цируемого участка, с учетом возможной фрагмен-тированности палеоДНК, не превышала 150 п.н., при этом каждый последующий фрагмент ампли-фицированной ДНК перекрывался с предыдущим. Все компоненты ПЦР-реакции на древних ДНК анализировали на возможность ее загрязнения современной ДНК. Во всех случаях контроли дали отрицательный результат. Определение половой принадлежности останков мумифицированных людей проводили с помощью амплификации локуса AMGX гена амелогенина, локализованного в половых хромосомах, с использованием праймеров: 5'-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG-3' и 5'-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3' в стандартной реакционной смеси. Проводили 30 циклов амплификации. Амплифицированные фрагменты разделяли в неденатурирующем 6%-ном ПААГ с последующей окраской бромистым эти-дием и просматривали в УФ-свете.
Рестрикционный анализ. Во всех древних и современных препаратах ДНК анализировали полиморфизм главной некодирующей области длиной 528 п.н. по сайтам рестрикции BamHI, EcoRV, Sau3Al (1 сайт рестрикции), Kpnl (2 сайта), Haelll (3 сайта), Rsal (5 сайтов рестрикции). Гидролиз ДНК для ПДРФ-анализа проводили при температуре 37°С в течение 4 ч в 50 мкл реакционной смеси, включающей 2 ед. фермента и соответствующий используемой рестриктазе стандартный буфер.
Рестрикционные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 5%-ном неденатурирующем ПААГ, приготовленном на ТБЕ-буфере. Полиморфизм учитывали по наличию (+) или отсутствию (-) сайта рестрикции. В качестве маркера использовали набор Weight Marker V, VI ("Boehringer Mannheim", Германия). Гель окрашивали бромистым этидием и просматривали в УФ-свете.
Таблица 1. Частоты сайтов рестрикции в Б-петле мтДНК в разных популяциях казахов
Рестриктаза Локализация Алматы Семипалатинск Алтай
сайта Частота, % Частота, % Частота, %
ВатН1 16390 (+) 0 (48) 0.0 0 (42) 0.0 1 (133) 0.7
Крп1 16049 (-) 6 (42) 14.3 5 (41) 12.2 4 (133) 3.0
16129 (-) 11 (49) 22.4 2 (41) 4.9 21 (133) 15.8
Нае111 16254(+) 0 (46) 0.0 1 (35) 2.9 2 (133) 1.5
16398(+) 0 (46) 0.0 1 (35) 2.9 0 (133) 0.0
16517(+) 29 (48) 60.4 36 (59) 61.1 86 (133) 64.6
RsaI 16125 (-) - - - - 6 (133) 4.5
16156 (-) 2 (51) 3.9 5 (49) 10.2 0 (133) 0.0
16208 (-) 9 (51) 17.6 6 (49) 12.4 1 (133) 0.8
16303 (-) 1 (40) 2.5 4 (49) 8.2 11 (133) 8.3
16310 (-) - - - - 15 (133) 11.3
5аи3А1 16215 (+) 0 (51) 0.0 1 (47) 2.1 0 (133) 0.0
БсоЯУ 16274(+) - - - - 2 (133) 1.5
Примечание. п - число полиморфных сайтов; N - объем выборки.
Статистический анализ. Достоверность различий в частотах встречаемости аллелей оценивали с помощью модифицированного критерия %2. Показатель генного разнообразия по полиморфным рестрикционным сайтам мтДНК (к) и по митоти-пам (к*) рассчитывали по формуле Нея и Таджи-ма [8]:
Н (Н *) = (1- ^ х2) N/( N -1),
где х - частота каждого типа мтДНК в популяции, N - объем выборки.
Расчет показателей генного и митотипическо-го разнообразия как для исследованных популяций, так и для сравниваемых групп проводили по одному и том
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.