МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 3, с. 320-328
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.852.083.18
полиморфизм штаммов зиьювлаьь из
ТИЕЯМ08иЬ¥1В00ХЮШ8, доминирующих в процессах высокотемпературного окисления золотомышьякового
концентрата
© 2011 г. А. Г. Булаев, Т. А. Пивоварова, В. С. Меламуд, И. А. Цаплина, А. Е. Журавлева, Т. Ф. Кондратьева1
Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Поступила в редакцию 03.11.2010 г.
Изучен состав ассоциации микроорганизмов, участвующих в процессе чанового биоокисления при 50°С концентрата упорной пирротинсодержащей пиритно-арсенопиритной золотомышьяковой руды Олимпиа-динского месторождения. В составе ассоциации доминировали два штамма БиЦЬЪасШш МегташуШоохШат, отличающиеся по филогенетическому положению от штаммов, использованных в качестве инокулята. При изучении их свойств были показаны значительные отличия изолятов как друг от друга, так и от штаммов, преобладающих в процессах биоокисления аналогичного по составу концентрата в других условиях: при 39°С с использованием традиционной чановой технологии или при 39°С с введением перед биоокислением дополнительной стадии химической обработки окисляемого концентрата раствором трехвалентного железа. Полученные результаты свидетельствуют о штаммовом и видовом разнообразии сульфобацилл в ассоциациях микроорганизмов, участвующих в процессах биоокисления концентратов в разных технологических режимах.
Ключевые слова: чановое биоокисление сульфидных руд, ассоциации хемолитотрофных ацидофи-лов, умеренные термофилы, Би1/оЬасШт thermosulfidooxidans, штаммовый полиморфизм, пульс-электрофорез, ПЦР.
Бактерии рода Sulfobacillus — это грамполо-жительные умеренно термофильные хемолито-трофные микроорганизмы, способные к окислению закисного железа, элементной серы, ее восстановленных соединений и сульфидных минералов и повсеместно распространенные на месторождениях сульфидных руд. Они впервые были описаны и выделены в отдельный род в 70-х годах ХХ века [1, 2]. В настоящее время известно несколько видов, относящихся к данному роду: S. thermosulfidooxidans, S. acidophilus, S. sibiricus, S. thermotolerans, 'S. olympiadicus', S. benefaciens [3—7]. Было показано, что активная окислительная деятельность данных микроорганизмов может приводить к значительному разогреву сульфидных руд. Представители рода могут играть значительную роль в процессах окисления сульфидных минералов в промышленных биогидрометаллургических технологиях, так как при повышенной температуре окислительные процессы проходят интенсивнее, чем в мезофильных условиях [8]. Впервые использование умеренно термофильных бактерий в процессе лабораторных испытаний биоокисления концентрата золотомышьяковой
1 Адрес для корреспонденции (e-mail: kondr@inmi.ru).
руды было осуществлено в ИНМИ РАН в 1999 году [9]. Данные испытания показали, что биоокисление концентрата при повышенной температуре с участием сульфобацилл происходит эффективнее, чем при использовании мезофильных микроорганизмов.
В настоящее время известно о применении сульфобацилл в промышленных процессах биоокисления коцентратов сульфидных руд. Они присутствуют в процессах отвального выщелачивания меди месторождения Монвайва (Австралия) [10], окисления золотосодержащей руды из месторождения Агнесс (ЮАР) [11], в пульпе реакторов чанового биовыщелачивания кобальтсодержа-щего пирита, проводимого на Казизском заводе в Уганде [12]. В статье [13] сообщается об использовании бактерий, близких к Б. thermosulfidooxidans, в процессе чанового бактериального вскрытия золота при температуре 45—55°С на заводе в Юанми (Австралия).
В России с 2001 г. в Красноярском крае работает золотоизвлекательная фабрика (ЗИФ) ЗАО "Полюс", использующая процесс бактериально-химического окисления концентратов, полученных из пирротинсодержащей пиритно-арсенопиритной зо-лотомышьяковой руды Олимпиадинского месторождения, по технологии ВЮМОКО [14]. Температура в реакторах 39—40°С, поэтому в процессе доми-
нирующую роль играют представители умеренно термофильных бактерий рода Sulfobacillus, в частности, нового вида 'S. olympiadicus' [15]. В бактериально-химических процессах на разных типах концентратов сульфидных руд в состав ассоциаций микроорганизмов, участвующих в их окислении, входят разные виды и штаммы Sulfobacillus [16].
Длительность процесса чанового бактериального окисления в промышленных реакторах (до 120 ч) и низкая степень окисления компонентов концентрата, таких, например, как пирит и антимонит, при температуре 39—40°С стимулировала разработку новых технологий. Одним из путей повышения эффективности является использование двустадий-ной схемы [17]. Мониторинг состава ассоциаций микроорганизмов в двустадийном процессе биоокисления флотоконцентрата сульфидной золото-мышьяковой руды при температуре 39°С выявил вытеснение микроорганизмов, использованных в качестве инокулята, новыми штаммами сульфоба-цилл. Идентификация и описание свойств одного из доминирующих микроорганизмов были проведены ранее [18].
Другим путем повышения эффективности процесса является увеличение температуры до 50°С и использование ассоциации штаммов Sulfobacillus, приспособленных к высокой температуре [19, 20]. Ведение процесса при повышенной температуре позволяет также снизить затраты на охлаждение промышленных реакторов. Процессы биоокисления сульфидных минералов экзотермичны, что приводит к повышению температуры до значений, неприемлемых для мезофилов.
Целью данного исследования является описание свойств штаммов рода Sulfobacillus, доминирующих в процессе окисления золотомышьякового концентрата при 50°С, и сравнение их со свойствами штаммов, выделенных при испытаниях двустадийной технологии и из пульпы реакторов действующей Олимпиадинской ЗИФ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В качестве инокулята была использована ассоциация микроорганизмов из пульпы реакторов ЗИФ ЗАО "Полюс" [14, 15], включающая штаммы 'S. olympiadicus', Leptospirillum ferrooxidans, Ferroplasma acidiphilum, A. ferrooxidans, A. thiooxidans, грибы Aspergillus niger; типовые штаммы S. thermosufidooxidans 1269Т, S. sibiricus N1T [2, 3], а также штаммы S. sibiricus Б1, Б2, Б3, OFO и SSO, выделенные из зон саморазогрева руды Олимпиадин-ского месторождения [20]. Объектом исследования являлись микроорганизмы ассоциации, осуществляющей биоокисление концентрата руды при 50°С, а также штамм S. thermosufidooxidans, выделенный из пульпы реакторов Олимпиадинской ЗИФ. В данном исследовании также проведено более полное описа-
ние свойств штамма S. thermosufidooxidans HT-4, опубликованное ранее [18].
Выделение чистых культур микроорганизмов и условия культивирования. Чистые культуры микроорганизмов выделяли методом посева жидкой фазы пульпы в десятикратных предельных разведениях на элективные среды при 50°C. Для разведений использовали модифицированную среду 9KS [21], дополненную 0.02% дрожжевого экстракта, и среду того же минерального состава, содержащую в качестве источника энергии элементную серу (10 г/л) вместо соли FeSO4 • 7H2O. При посеве на среду с элементной серой добавляли 2 мл/л раствора микроэлементов следующего состава (г/л): FeCl3 • 6H2O —1.1, CuSO4 • 5H2O - 0.05, H3BO3 - 0.2, MnSO4 • H2O - 0.2, NaMoO4 • 2H2O - 0.08, CoCl2 • 6H2O - 0.06, ZnSO4 • 7H2O - 0.09. Чистые культуры микроорганизмов получали при повторных рассевах методом предельных десятикратных разведений. Чистоту культур проверяли по отсутствию роста в жидкой питательной среде 9К, содержащей 15 г/л дрожжевого экстракта, или 15 г/л пептона, или 5.5 г/л пирувата натрия вместо соли закисного железа.
Микроорганизмы выращивали на ротационной качалке (170 об/мин) при температуре 50°С в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 100 мл среды, внося 10 мл инокулята.
Штаммы поддерживали на среде 9KS с 0.02% дрожжевого экстракта и 1 мМ тиосульфатом натрия.
Световая микроскопия. Количественный учет микроорганизмов проводили методом прямого счета клеток в световом микроскопе Ampival ("Carl Zeiss") с фазово-контрастной приставкой. Просчитывали 20 полей зрения.
Электронная микроскопия. Тотальные препараты клеток для электронной микроскопии получали центрифугированием культуры при 4600 g в течение трех минут. При росте на закисном железе или сульфидных концентратах клетки самоконтрастирова-лись соединениями оксидного железа и дополнительного окрашивания не требовалось. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100C (Япония).
Изучение физиологических свойств. Влияние температуры и pH на рост микроорганизмов изучали при их развитии в среде 9KS с 0.02% дрожжевого экстракта и 1 мМ тиосульфатом натрия.
Способность микроорганизмов к автотрофному росту определяли при их культивировании в среде 9KS, не содержащей органических веществ. Способность микроорганизмов к росту на органических веществах оценивали при посеве в минеральную основу среды 9KS без закисного железа, содержащую одно из соединений: глюкозу, фруктозу, сахарозу, глицин, метионин, цитрат, ацетат, сукцинат, глута-тион, дрожжевой экстракт в концентрации 0.05%. Способность микроорганизмов к миксотрофному росту оценивали при их развитии в среде 9KS с пере-
Таблица 1. Морфологические свойства штаммов Sulfobacillus sp.
Штамм Размеры, мкм Жгутикование Образование эндоспор
НТ-1 1.3-1.8 х 1.5-6.0 Полярное Не наблюдается
НТ-3 0.5-1.0 х 0.3-2.0 Отсутствует +
НТ-4 0.5-0.6 х 1.4-2.0 Монотрихальное +
НТ-5 0.5-1.0 х 1.0-4.0 Перитрихальное +
численными органическими веществами в концентрации 0.02%. При изучении роста микроорганизмов в различных условиях делали несколько пассажей. Значение pH среды доводили 10 N H2SO4 до 2.5 при росте на S0, до 1.9-2.0 при росте на органических веществах, до 1.7-1.8 при росте на Fe2+. Определение концентрации ионов закисного и оксидного железа проводили методом комплексонометри-ческого титрования [22].
Анализ филогенетического положения микроорганизмов методами ПЦР и секвенирования гена 16S рРНК. Амплификацию и секвенирование генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных для большинства прок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.