научная статья по теме ПОЛИМОРФИЗМ SSR-АЛЛЕЛЕЙ СОРТОВ ГРУШИ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В БЕЛАРУСИ Биология

Текст научной статьи на тему «ПОЛИМОРФИЗМ SSR-АЛЛЕЛЕЙ СОРТОВ ГРУШИ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В БЕЛАРУСИ»

ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ

УДК 631.524.86:634.13

ПОЛИМОРФИЗМ SSR-АЛЛЕЛЕЙ СОРТОВ ГРУШИ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В БЕЛАРУСИ

© 2011 г. О. Ю. Урбанович1, З. А. Козловская2, О. А. Якимович2, Н. А. Картель1

Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси,

Минск 220072, Республика Беларусь e-mail: O.Urbanovich@igc.bas-net.by 2Республиканское унитарное предприятие Институт плодоводства, Минская обл., пос. Самохваловичи 223013,

Республика Беларусь e-mail: zoya-kozlovskaya@tut.by Поступила в редакцию 17.06.2010 г.

С помощью SSR-маркеров, разработанных для Malus х domestica Borkh., исследован генетический полиморфизм 43 образцов груши, культивируемых в Беларуси. Выявлено 217 аллелей со средним значением 12.8 аллеля на маркер. Средние значения PIC составляли 0.81, числа информативных аллелей — 6.49. Уровень гетерозиготности находился в пределах от 0.30 до 0.84. Проведено сравнение генетического разнообразия SSR-аллелей в геноме груши и яблони. Предложен метод идентификации коммерческих сортов груши с помощью набора из шести SSR-маркеров.

Груша является важной плодовой культурой во многих странах мира. Она выращивается человеком более 3000 лет. За это время было создано более пяти тысяч сортов груши, различающихся по происхождению, внешнему виду, товарным качествам и другим характеристикам. Значительное увеличение сортового разнообразия этой культуры, как и других хозяйственно важных видов, наблюдается в последние десятилетия. Так, например, если до 1998 г. в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь было внесено всего четыре сорта груши, то спустя десять лет список состоял уже из 16 сортов.

Сорта груши, потребляемые человеком, относятся к нескольким видам. В Европе и Америке возделывается в основном европейская груша (Pyrus communis L.). В Китае и Японии получили распространение уссурийская груша (P. ussuriensis Maxim.), груша Бретшнейдера (P. bretschneideri Rehd.) и груша грушелистная (P. pyrifolia Naka) [1, 2]. Кроме того, известно еще около двух десятков диких видов груши, произрастающих в Азии, Европе и Северной Африке [3, 4]. Виды груши относятся к роду Pyrus, подсемейству Maloideae, семейству Rosaceae. Для представителей рода характерно базовое число хромосом 17 (2n = 34). Предполагается, что груши являются амфиди-плоидами, которые произошли от двух предко-вых видов Rosaceae [5]. Виды груши относительно легко скрещиваются между собой, что позволяет получить межвидовые гибриды. Именно с гибридизацией связывают происхождение отдельных видов груши, в том числе и P. communis. Способность видов груши образовывать межвидовые ги-

бриды широко используется в селекции при создании новых сортов. Определенная часть современных сортов является гибридами между европейской грушей и грушами уссурийской и грушелистной.

Традиционно для описания генетического разнообразия и идентификации сортов груши используют морфологические признаки. Однако их становится недостаточно по мере создания все большего количества сортов. В настоящее время для исследования генетического разнообразия сортов груши привлекаются молекулярные маркеры, число которых практически не ограничено. Среди них маркеры типа RFLP, RAPD, ISSR, AFLP [6—11]. Наиболее удобными для идентификации генотипов являются SSR (simple sequence repeat) маркеры, выявляемые в результате ПЦР. Они распределены по всему геному, высокополиморфны, кодоминантны, обеспечивают достоверную воспроизводимость результатов и поддаются автоматизации [12]. Еще одним положительным свойством SSR-маркеров является то, что они могут иметь сайты связывания в геноме не только того вида, для которого они были созданы, но и в геноме близкородственных видов. Так, SSR-маркеры, созданные на основе Malus х domestica, успешно применяются для исследования и установления филогенетических связей между сортами яблони, дикими видами Malus и полученными на их основе гибридами [13, 14]. SSR-маркеры яблони успешно были использованы для анализа Pyrus pyrifolia, P. ussuriensis, P. communis, P. calleryana и межвидовых гибридов груши благодаря высокой консервативности фланкирую-

щих простые повторы последовательностей этих видов [15]. Они находят гомологичные сайты связывания в геноме другого представителя подсемейства Maloideae — айвы (Cydonia oblonga Mill.) [16]. При этом значительная часть SSR-маркеров расположена в гомологичных областях хромосом яблони и груши [17, 18]. Разработанные позже EST-SSRs (expressed sequence tags—simple sequence repeats) маркеры из EST базы данных M. x domestica находят с разной частотой сайты связывания в геноме 14 видов семейства Rosaceae [19]. Данное свойство SSR-маркеров делает их удобными для исследования генетического разнообразия и разработки универсальных методов идентификации представителей семейства. В частности, с помощью SSR-маркеров исследовано генетическое разнообразие коммерческих сортов европейской груши и установлены филогенетические связи между ними [20]. Вместе с тем сведения о генетическом разнообразии сортов груши белорусской, российской и украинской селекции отсутствуют.

Представленное исследование было проведено с целью изучения генетического разнообразия сортов груши различного происхождения, выращиваемых в Беларуси, и разработки молекулярных методов идентификации сортов этой культуры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал исследования. Для проведения исследований было использовано 43 образца груши из коллекции РУП "Институт плодоводства": сорта и гибриды селекции Беларуси, России, Украины, а также других стран, в том числе 16 сортов, включенных в Государственный реестр сортов и древесно-кустарниковых пород Республики Беларусь (табл. 1).

Выделение ДНК. Препараты ДНК выделяли с помощью Genomic DNA Purification Kit фирмы "Fermentas". Выделение проводили из листового материала груши согласно рекомендованному протоколу. Пробы ДНК растворяли в 100 мкл би-дистилированной воды и хранили при —20°С. Для проведения ПЦР образцы ДНК разводили до концентрации 20 мкг/мкл.

Условия амплификации. Реакцию амплификации проводили с помощью SSR-маркеров [13, 21]. Реакционная смесь для проведения ПЦР объемом 20 мкл имела следующий состав: 67 мМ трис-HCl рН 8.8, 16 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ dNTP, 250 нМ прямого и обратного прай-меров, 50 мкг ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы. Условия проведения реакции: 94°С — 3 мин; 40 циклов 94°С - 40 с, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 1 цикл: 72°С — 10 мин. Для проведения реакции использовали амплификатор MyCicler (BIO-RAD).

Идентификация фрагментов амплификации. Продукты амплификации разделяли методом

электрофореза в секвенирующем акриламидном геле. Для проведения электрофореза использовали ДНК-секвенатор ALFexpress II (Amersham Biosciences). Разделение продуктов амплификации осуществляли в 6%-ном акриламидном геле толщиной 0.3 мм. Электрофорез проводили в 1х ТВЕ-буфере (0.089 М трис-HCl, 0.089 М борная кислота, 0.002 М EDTA рН 8.0) при следующих условиях: 400-600 B, 40 мА, 50 Вт, 55°С, интервал детекции 0.5 с, время проведения 1-2 ч. Результаты электрофоретического разделения документировались автоматически с помощью программного обеспечения секвенатора.

Статистическая обработка даннъх. Для оценки уровня полиморфизма использовали значение коэффициента полиморфизма PIC (polymorphic information content). Коэффициент полиморфизма был рассчитан отдельно для каждого локуса микросателлитных последовательностей генома груши. Значение коэффициента вычисляли по формуле:

PIC = 1 - Е(Р,)2, где P — частота встречаемости i-ого аллеля [22].

Число эффективных аллелей (Ne) рассчитывали по формуле Ne = 1/(1 — PIC).

Уровень гетерозиготности Ho был рассчитан как отношение гетерозиготных генотипов к общему количеству генотипов.

Дендрограмма генетического сходства сортов была получена с помощью программы Treecon методом UPGMA, основываясь на коэффициенте генетического сходства Nei и Li [23].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В исследовании использовали 17 SSR-марке-ров, разработанных для яблони [13, 21]. Они расположены на разных хромосомах генома (табл. 2). Размер аллелей SSR-локусов был рассчитан относительно сорта яблони Discovery, выбранного в качестве стандарта [24]. С помощью указанных маркеров в геноме 43 образцов груши было выявлено 217 полиморфных аллелей. Количество полиморфных аллелей на маркер колебалось от 4 до 21 со средним значением 12.8. (табл. 2). Наименьшее количество аллелей было обнаружено в локу-се CH01b12, максимальное — в локусе CH02c02a. Три маркера CH02b12, CH02c02a и CH03g12 выявляют более двух аллелей и, следовательно, имеют более одного сайта связывания в геноме груши.

Количество полиморфных аллелей в геноме груши несколько ниже, чем у яблони в этих же ло-кусах. Среднее количество аллелей в геноме яблони составляет 16.5. Следует отметить, что результаты приведены для 43 генотипов груши и 108 генотипов яблони. Выявление большего количества аллелей среди генотипов яблони связано с боль-

Таблица 1. Происхождение и родословная образцов груши, включенных в исследование

Название сорта Страна происхождения Комбинация скрещивания

Аллегро Россия Осенняя Яковлева св. оп.

Белорусская поздняя Беларусь Добрая Луиза св. оп.

Бере лошицкая Беларусь Бере слуцкая х Курская молдавка

Бере Люка Франция Неизвестно

Большая летняя Украина Ильинка х Любимица Каплана

Велеса Россия Венера х Лесная красавица

Верная » Гибрид № 3 х Жозефина Мехельнская

Веснянка » Триумф Виенны х Деканка зимняя

Видная » Гибрид VI-53-67 х смесь пыльцы южных сортов

Виктория Украина Бере Боск х Толстобежка

Вродлыва » Бере Боск х Оливье де Серр

Выставочная » Основянская х смесь пыльцы (Бере Боск + Сен Жермен)

Гибрид 25 Россия (Маргарита Марилья х P. communis) х P. yematsuana

Десертная россошанская » Бере зимняя Мичурина х Лесная красавица

Духмяная Беларусь Александровка х Любимица Клаппа

Дюшес летний » Неизвестно

Есенинская Россия Северянка х Оливье де Серр

Забава Беларусь Александровка х Любимица Клаппа

Золотоворотская Украина Парижанка х Оливье де Серр

Колхозница Беларусь Виневка х Деканка зимняя

Ко

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком