МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1014-1016
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 575:599.9 Краткое сообщение
ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ В ГЕНАХ СЕМЕЙСТВА ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ (-308G/A TNF И +252А/0 LTA) У ЛИЦ С АЛКОГОЛЬНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПЕЧЕНИ
© 2004 г. 3. А. Шангареева*, Т. В. Викторова, А. Ф. Сагидуллин
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа, 450054
Поступила в редакцию 16.12.2003 г.
Ключевые слова: генетика алкогольной болезни печени; полимеразная цепная реакция; полиморфизм генов семейства факторов некроза опухолей (-308G/A TNF и +252A/G LTA).
THE TNF FAMILY GENES POLYMORPHISMS (-308G/A TNF AND +252A/G LTA) AND ALCOHOLIC LIVER DISEASE, by Z. A. Shangareeva*, T. V. Victorova, A. F. Sagidullin (Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Science, Ufa, 450054 Russia; E-mail: ecolab_203@mail.ru).
В последнее время исследуют гиперфункцию иммунной системы как возможного медиатора алкогольного повреждения печени. Роль цитоки-нов несомненна, поскольку они занимают центральное место в межклеточных взаимодействиях, регуляции иммунных нарушений и пролифера-тивных реакций при алкогольной болезни печени (АБП). Значение иммунологической компоненты можно рассматривать в контексте генетической предрасположенности и возможности развития АБП даже после прекращения употребления этанола.
Различные изменения иммунитета у лиц, длительно злоупотребляющих алкоголем, обусловлены преимущественно бактериальной эндотоксеми-ей, поскольку хроническое употребление этанола способствует ее развитию. Эндотоксины относятся к классу липополисахаридов и являются инициаторами локального и системного воспалительного ответа. Гепатоцеллюлярный ответ на эндоток-семию проявляется в том, что начинается синтез и секреция первичных медиаторов воспаления -цитокинов [1]. Гиперпродукция провоспалитель-ных цитокинов (фактора некроза опухолей, ФНО-а, лимфотоксина, ЛТ-а, а также интерлей-кинов, ИЛ 1, 6, 8) влияет на патогенез повреждения печени у больных алкогольным гепатитом, так как уровень цитокинов в сыворотке крови коррелируют с тяжестью течения болезни [1-3]. Купферовские клетки печени - основные продуценты цитокинов. В печени синтезируется большое количество ФНО-а. Избыточная секреция медиатора ведет к увеличению объема гепатоци-тов приблизительно на 20% и обусловливает быстрое формирование гепатомегалии. ФНО-а совместно с ИЛ-6 стимулируют синтез и высвобож-
* Эл. почта: ecolab_203@mail.ru
дение в системную циркуляцию белков острой фазы, стимулируют нейтрофилы к высвобождению ряда биологически активных молекул [1]. Помимо этого, белки ФНО/ЛТ участвуют в регуляции экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости - HLA класса I - в эндотелии сосудов, что обеспечивает участие ФНО/ЛТ в развитии аутоиммунной патологии и отторжения трансплантата [4].
Гены, контролирующие синтез ФНО-а (Tumor Necrosis Factor, TNF) и ЛТ-а (Limphotoxine, LTA), принадлежат к семейству генов факторов некроза опухолей, они тесно сцеплены и располагаются на коротком плече хромосомы 6 (6p21.1-6p21.3) рядом с генами главного комплекса гистосовместимости класса III. Эти гены полиморфны [5, 6].
Представленные в литературе данные по ассоциации ряда полиморфных вариантов гена TNF с патологией печени противоречивы. Так, например, при изучении ассоциации вариантов полиморфизма (-308G/A и -238G/A) промоторного региона гена TNF в выборке больных алкогольным стеатогепатитом выявлена связь с заболеванием по локусу -238G/A, в то время как по варианту -308G/A она не обнаружена [7]. В более поздних публикациях эта группа исследователей указывает на связь полиморфного варианта -308G/A гена TNF с тяжестью течения первичного билиар-ного цирроза [8]. При исследовании другими авторами группы больных первичным билиарным циррозом обнаружена связь с гетерозиготным генотипом GA полиморфного локуса -308G/A, но она трактуется как протективная, а связь с полиморфизмом (-238G/A) не выявлена [9]. В опытах на купферовых клетках крыс, подвергавшихся длительной нагрузке этанолом, также показана ги-
ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ В ГЕНАХ СЕМЕЙСТВА ФАКТОРОВ НЕКРОЗА 1015
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов семейства факторов некроза опухолей (-308 G/A TNF и +252 A/G LTÄ) у лиц с алкогольной болезнью печени
Аллели и генотипы Больные АБП (n = 126) Контроль(n =120) X2 (p) OR №or)
число % число %
TNF G 190 75.40 196 81.67 2.50 (0.11) 0.68 (0.44-1.09)
A 62 24.60 44 18.33 1.45 (0.92-2.29)
GG 69 54.76 78 65.00 2.27 (0.13) 0.65 (0.38-1.13)
GA 52 41.27 40 33.33 1.33 (0.24) 1.41 (0.81-2.44)
AA 5 3.97 2 1.67 0.49 (0.48) 2.44 (0.41-18.58)
LTA A 191 75.79 181 75.42 0.01 (1.01) 1.02 (0.66-1.57)
G 61 24.21 59 24.58 0.98 (0.64-1.51)
AA 71 56.35 64 53.33 0.12 (0.73) 1.13 (0.66-1.93)
AG 49 38.89 53 44.17 0.51 (0.48) 0.81 (0.47-1.38)
GG 6 4.76 3 2.50 0.37 (0.55) 1.95 (0.42-10.10)
Примечание. п - объем выборки; р - уровень значимости различий по частотам генотипов и аллелей; ОЯ - показатель отношения шансов; ДИок - 95 % доверительный интервал показателя ОЯ.
перпродукция ФНО-а под влиянием бактериального липополисахарида [10, 11].
Целью настоящего исследования явилось изучение возможной связи полиморфных маркеров в генах семейства факторов некроза опухолей (TNF и LTÄ) с АБП. Обследовано 126 пациентов мужского пола в возрасте от 28 до 59 лет, страдающих хроническим алкоголизмом с проявлениями АБП и проходивших курс стационарной терапии в Республиканском наркологическом диспансере (г. Уфа). Критерии отбора в группу были следующие: длительный алкогольный анамнез, отсутствие в крови маркеров вирусного гепатита и других поражений печени. Контрольную группу составили 120 здоровых мужчин, не злоупотребляющих алкоголем, подобранные по соответствию возраста и этнической принадлежности исследуемой группе. ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [12]. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма локусов -308G/A TNF и + 252A/G LTÄ проводили с помощью методов полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа. Условия ПЦР варьировали в зависимости от используемого праймера. Полиморфизм, обусловленный заменой G на A в положении -308 промоторной области гена TNF (-308G/A), выявляли с использованием праймеров, один из которых содержит искусственную однонуклеотидную замену, создающую сайт, узнаваемый эндонук-леазой рестрикции Bsp19I [5, 6]. Для амплификации участка ДНК, содержащего полиморфизм (+252 A/G) в первом интроне гена LTA, использовали праймеры, описанные ранее [13]. Для рестрик-ционного анализа амплифицированных фрагментов использовали эндонуклеазу Bsp19I фирмы "Сибэнзим" в стандартных условиях. Соответст-
вие наблюдаемых частот аллелей и генотипов теоретически ожидаемым оценивали по критерию X2 с коррекцией Йетса (RxC-статистика) [14]. Попарное сравнение частот аллелей и генотипов проводили с использованием двустороннего критерия Фишера. О силе ассоциации аллелей и генотипов с предрасположенностью к АБП судили по величине отношения шансов (Odds Ratio, OR) [15].
Известно, что транзиция G/A в позиции -308 промоторной области гена TNF сопровождается повышением продукции соответствующего цито-кина почти в два раза, что показано при изучении B-клеточной линии [6]. Имеется ли подобная связь в случае купферовских клеток, не известно. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов TNF (-308G/A) и LTA (+252A/G) у больных АБП представлены в таблице. Анализ гена TNF показал, что среди больных АБП чаще встречается аллель -308А (24.60%), чем в группе здоровых лиц (18.33%). Эта тенденция обусловлена большей распространенностью генотипов GA (41.27%) и AA (3.97%) среди больных АБП в сравнении с контрольной группой (33.33% и 1.67% соответственно). Обнаружена тенденция к снижению частоты встречаемости гомозиготного генотипа GG у больных АБП до 54.76% по сравнению с контролем - 65.00%. Однако величины, характеризующие различия, не достигают статистически достоверных значений.
Другим медиатором воспаления, играющим важную роль в прогрессировании АБП, является ЛТ-а. Наиболее изучен полиморфизм +252A/G гена LTA. Данная транзиция сопровождается повышенным уровнем синтеза цитокина в периферических моноцитах крови [13]. Полиморфизм +252A/G гена LTA при заболеваниях печени изу-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ том 38 < 6
2004
1016
ШАНГАРЕЕВА и др.
чен недостаточно. В результате молекулярно-ге-нетического анализа гена LTA в сравниваемых группах каких-либо достоверно значимых различий в распределении аллелей и генотипов не обнаружено. Следует лишь отметить, что прослеживается тенденция к возрастанию частоты встречаемости гомозиготного генотипа GG (4.76%) у больных АБП в сравнении с контролем (2.50%).
Таким образом, при исследовании полиморфизма двух генов семейства факторов некроза опухолей (-308G/A TNF и + 252A/G LT А) у больных АБП предполагаемой ассоциации с заболеванием не выявлено, поскольку различия в распределении частот аллелей и генотипов не являются статистически значимыми. Наиболее вероятной причиной обнаруженных тенденций является не изменение уровня продукции ФНО/ЛТ, а генетическое сцепление полиморфных вариантов в локусе ФНО/ЛТ с аллелями молекул главного комплекса гистосовместимости, которые, действительно, могут влиять на иммунологичесие реакции, возникающие при патологии печени. Данная гипотеза требует дальнейшего изучения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ивашкин В.Т. 1998. Клеточная и молекулярная биология воспаления печени. Рос. ж. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 5, 13-17.
2. Фрейдлин И.С., Артеменко Н.К., Фрейдлин Г.С. 1998. Дефекты цитокиновой сети и принципы их коррекции. Иммунология. 6, 23-25.
3. Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю. 2001. Цитокины - общая система гомеостатичес-кой регуляции клеточных функций. Цитология. 12, 1101-1110.
4. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. 2003. Геномика HLA: новые возможности молекулярной генетики человека в диагностике и терапии. Молекуляр. медицина. 1,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.