МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 114-118
ГЕНОМИКА, ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.2:616,577.2:579
ПОЛИМОРФНЫЙ ВАРИАНТ MnSOD A16V И РИСК РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ*
© 2015 г. S. F. Haghighi1, Z. Salehi1, M. R. Sabouri2, N. Abbasi3
department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran 2Department of Ophthalmology, Guilan University of Medical Sciences (GUMS), Rasht, Iran 3Department of Biology, International Pardis, University of Guilan, Rasht, Iran Поступила в редакцию 08.06.2014 г. Принята к печати 21.07.2014 г.
Диабетическая ретинопатия — наиболее распространенное микрососудистое осложнение сахарного диабета и главная причина потери зрения в развитых странах. В развитии микроангиопатии при сахарном диабете важную роль играет окислительный стресс. Марганцевая супероксиддисмутаза (MnSOD) — ключевой антиоксидантный фермент митохондрий, участвует в защите клеток от агентов, индуцирующих окислительный стресс. В представленной работе проанализирована возможность ассоциации полиморфизма А16У (C47T) MnSOD с развитием диабетической ретинопатии у жителей Северного Ирана. С этой целью методом ПЦР—ПДРФ проведено генотипирование полиморфизма A16V MnSOD у 140 больных диабетической ретинопатией и 140 здоровых добровольцев в возрасте от 35 до 75 лет. Частоты генотипов АА, АУ и УУ составили 5.71, 71.43 и 22.86% у больных диабетической ретинопатией и 21.43, 38.57 и 40% в контрольной группе. У больных наблюдалось значительное повышение частоты генотипа AV по сравнению с контролем (OR = 6.94, 95% CI = 2.98—16.20, P < 0.0001). Таким образом, полиморфизм A16V MnSOD может быть ассоциирован с риском развития диабетической ретинопатии у жителей Северного Ирана. Однако для более точного понимания связи между диабетической ретинопатией и полиморфизмом А16У MnSOD необходимо проведение исследований на больших популяционных выборках.
Ключевые слова: диабетическая ретинопатия, генетический полиморфизм, окислительный стресс.
POLYMORPHIC VARIANT OF MnSOD A16V AND RISK OF DIABETIC RETINOPATHY, by S. F. Haghighi1, Z. Salehi1*, M. R. Sabouri2, N. Abbasi3 ^Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran; 2Department of Ophthalmology, Guilan University of Medical Sciences (GUMS), Rasht, Iran; 3Department of Biology, International Pardis, University of Guilan, Rasht, Iran; *e-mail: geneticzs@ya-hoo.co.uk). Diabetic retinopathy is the most common microvascular complication of diabetes and a leading cause of blindness in industrialized countries. Oxidative stress plays an important role in the development of microangiopathic complications in diabetes. Manganese superoxide dismutase (MnSOD) is a key mitochondrial antioxidant enzyme in the cellular defense against agents that induce oxidative stress. The aim of the present study was to assess whether the MnSOD A16V (C47T) polymorphism is associated with Diabetic retinopathy in northern Iran. 140 patients with Diabetic retinopathy and 140 healthy individuals, aged 30 to 75 years old, participated in this study. For genotyping of the MnSOD A16V polymorphism, polymerase chain reaction — restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used. The prevalence of genotype frequencies of AA, AV, УУ in Diabetic retinopathy subject were 5.71, 71.43 and 22.86%, respectively while in controls were 21.43, 38.57 and 40%, respectively. Significantly increased frequency of AV genotype was observed in patients compared with controls (OR = 6.94, 95% CI = 2.98-16.20, P < 0.0001). In conclusion, it is suggested that the MnSOD A16V polymorphism may be associated with the risk of Diabetic retinopathy in northern Iran. However, larger population-based studies are needed for clarifying the relation between Diabetic retinopathy and MnSOD A16V polymorphism.
Keywords: Diabetic retinopathy, gene polymorphism, oxidative stress. DOI: 10.7868/S002689841501005X
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: geneticzs@yahoo.co.uk
ПОЛИМОРФНЫЙ ВAPИAHТ MnSOD A1ÓV
115
Диабетическая ретинопатия (ДР) — одно из наиболее распространенных микрососудистых осложнений сахарного диабета и одна из главных причин потери зрения у лиц работоспособного возраста. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ДР обуславливает 4.8% случаев слепоты в мире [1]. У больных сахарным диабетом типа 1 ДР встречается в 2.5 раза чаще, чем при сахарном диабете типа 2 [2]. К первым признакам ДР относятся такие повреждения микрососудов сетчатки, как микроаневризмы, кровоизлияния и твердые экссудаты, ватные пятна, внутриретинальные микрососудистые аномалии и венозная кровоточивость, наблюдаемые на непролиферативной стадии ДР. Рост новых аномальных сосудов, который часто приводит к кровоизлияниям в стекловидное тело и прере-тинальным кровоизлияниям, считается главным признаком развития тяжелой формы ДР — проли-феративной [3].
ДР — многофакторное заболевание со сложным взаимодействием внешнесредовых и генетических факторов [4, 5]. Первичным патогенетическим фактором в развитии и прогрессии сосудистых осложнений при сахарном диабете считается гипергликемия [6]. Тем не менее, у некоторых больных микрососудистые осложнения не развиваются даже при большой длительности заболевания в отсутствие какого-либо контроля за уровнем сахара, тогда как у ряда больных со строгим метаболическим контролем ДР возникает в течение короткого промежутка времени [5]. Гипергликемия воздействует на несколько биохимических путей [7]. При гипергликемии развивается окислительный стресс и образуются активные формы кислорода (АФК), вызывающие повреждение сосудов [8].
Эндогенные антиоксидантные ферменты, такие как Мп-супероксиддисмутаза (Мп8ОЭ), ка-талаза, глутатиопероксидаза и пероксиредоксин, играют значительную роль в защите клеток от АФК [9]. Мп8ОЭ — ключевой фермент защиты клеток от митохондриальных АФК, превращает АФК в пероксид водорода (Н2О2), который нейтрализуется каталазой и глутатионпероксидазой до Н2О и О2 [10]. Ген ЫпБОБ, локализованный в области д25.3 хромосомы 6, состоит из пяти экзонов [11]. Описано несколько вариаций гена ШпБОБ человека [12], среди которых наиболее распространен однонуклеотидный полиморфизм Л16У (С47Т) в кодоне 16 гена ЫпБОБ, в последовательности, кодирующей фрагмент из 24 аминокислотных остатков, который направляет фермент в митохондрии (МТ8-домен). Этот полиморфизм приводит к замене аланина (С) на валин (Т) и изменению вторичной структуры с а-спирали на Р-лист [12].
Эффективность импорта белка, содержащего валин, снижается на 11% по сравнению с белком, содержащим аланин (А-форма). А-форма Мп8ОЭ локализуется в митохондриях на 30— 40% более эф-
фективно, чем валин-содержащий белок [13]. Тем не менее, этот полиморфизм вызывает также снижение стабильности мРНК [14]. Цель представленной работы состояла в выяснении возможной ассоциации полиморфизма A16V MnSOD с ДР в популяции Северного Ирана.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Больные. Для проведения генетического анализа рекрутировали 140 больных сахарным диабетом типа 2 с ДР (80 женщин и 60 мужчин) и 140 здоровых индивидов из популяции Северного Ирана, сходных по полу и возрасту, у которых получили информированное согласие на участие в обследовании. Все они прошли офтальмологическое обследование, включая проверку остроты зрения, осмотр с помощью щелевой лампы и офтальмоскопию для подтверждения наличия/отсутствия ДР. Возраст больных варьировал от 30 до 75 лет. Контрольная группа состояла из неродственных индивидов без сахарного диабета типа 2 в семейной истории, с нормальным содержанием глики-рованного гемоглобина (тест HbA1c).
Генотипирование Суммарную геномную ДНК экстрагировали из лейкоцитов периферической крови с использованием набора Gpp Solution kit ("Gene Pajoohan Pouya", Иран) согласно рекомендациям фирмы. Для генотипирования полиморфизма A16V гена MnSOD использовали метод ПЦР-ПДРФ. Фрагмент ДНК (243 п.н.), содержащий полиморфизм A16V, амплифицировали с использованием одной пары праймеров (прямого: 5'-CGGGCTGTGCTTTCTCGTC-3'; обратного: 5'-TCAGCCTGGAAC CTACC CTT-3'), которую подбирали с помощью программы Oligo primer analysis software (Version 7.54, "Molecular Biology Insights", СШA). Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 30 нг геномной ДНК, 1x ПЦР-буфер, 0.2 мM dNTP, 1.5 мM MgCl2, 0.5 мкЫ каждого праймера и 1.5 ед. Taq-ДНК-полимеразы ("Bioflux", Япония).
Aмплификацию проводили по программируемому протоколу: денатурация ДНК при 950C в течение 5 мин; затем 35 циклов амплификации (денатурация при 950с, 45 с; отжиг праймеров при 580C, 1 мин; удлинение праймеров при 720C, 45 с) и конечное удлинение при 720C в течение 5 мин с последующим охлаждением до 40с. Продукты ПЦР расщепляли рестрикционной эндонукле-азой Bsawl ("New England Biolabs", СШA). Продукт ПЦР, соответствующий аллелю V, разрезается этой рестриктазой на фрагменты длиной 196 и 47 п.н., в отличие от продукта, соответствующего аллелю A (243 п.н.). ПЦР-продукты и рестрикци-онные фрагменты разделяли в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, и визуализировали с помощью системы документации гелей ("Bio Rad", СШA). Aнализиpовали резуль-
116
HAGHIGHI и др.
L 1 2 3 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клинические характеристики участников обследования представлены в табл. 1. Продукты ПЦР размером 243 п.н. приведены на рис. 1. Гено-типирование полиморфизма A16V выполнено согласно результатам ферментативного расщепления (рис. 2).
Распределение генотипов и частоты аллелей полиморфизма A16V гена MnSOD приведены в табл. 2. Высокая частота гетерозиготного генотипа AV (71.43%) выявлена в группе больных сахарным диабетом. Установлено, что у гетерозигот AV риск развития ДР повышен в 6.94 раза (OR = 6.94, 95% CI = 2.98-16.20, P < 0.0001).
Гомозиготный генотип VV имели только 32 (22.86%) индивида из группы больных и 56 (40%) индивидов из группы контроль. Не обнаружено статистически значимых различий в распределении аллелей A и V в группах случай и контроль (P = 0.93).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В представленной работе проанализирована возможная ассо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.