БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 4, с. 268 - 274
УДК 577.1.083.3
ПОЛИПЕПТИДЫ ИЗ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШИ, УЗНАЮЩИХ ГЛЮКОЗАМИНИЛМУРАМОИЛДИПЕПТИДЫ
© 1995 г. Т. Н. Головина, М. В. Сума рока, Л. В. Самохвалова, 10. В. Шсбзухов, Е. А. Макаров, В. А. Несмеянов*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, I ¡7871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.04.94 г. После доработки 06.06.94 г.
С использованием радиолигандного анализа показано, что на поверхности перитонеальных макрофагов мыши имеется несколько сотен высокоаффинных ОМОР-саязывающих центров с константой связывания 350 пМ. Методом фотоаффинного мечения внутри перитонеальных макрофагов мыши обнаружены белки с молекулярными массами 32 - 34 и 38 кДа, специфически связывающие СМРР. Белки с массами 32 - 34 кДа обнаруживались также методом Всстерн-блот-анализа с использованием биотинилированного конъюгата полиакриламида с иммобилизованным на нем ОМОР-ЬуБ ((СМВР-Ьу8)-РАА-(В1)) в клеточном лизате перитонеальных макрофагов мыши.
Ключевые слова: рецепторы мурамоилпептидов, фотоаффинное меченые, радиолигандный анализ.
N - А це ти л г л ю ко з а мини л - (р 1-4)-1Ч-ацетил-мурамоил-£-аланил-£>-изоглутамин (СМОР) -фрагмент бактериальной клеточной стенки, обладающий множеством биологических активностей. В частности, С МЭР проявляет адъювантное и противоопухолевое действие, индуцирует неспецифическую устойчивость к вирусным и бактериальным инфекциям [1, 2]. Механизм действия С МОР, как и других мурамоилпептидов, до настоящего времени остается малоизученным. Среди возможных молекулярных механизмов биологической активности мурамоилпептидов наиболее вероятным является рецеиторный. Доводом в его пользу может служить стереоспецифич-ность этих соединений, а также насыщаемый характер зависимости "доза-ответ" для некоторых биологических эффектов [3 - 5]. К началу данной работы имеющиеся в литературе сведения о мурамоилпептидсвязывающих молекулах
Сокращения: GMDP - N-ацетилглюкозамянилЧр I -4)-N-ацетилмурамоил-^-аланил-О-изоглутамин; GMDP-Lys -М-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-^ацетилмурамоил-Ь-ала-нил-О-иэоглутамиллизин; L-GMDP - N-ацетилглюкоэ-аминил-(Р1-4)-М-ацетилмурамоил-£-аланил-/,-изоглутамин; MDP - М-ацетилмурамоил-£-алаиил-0-изоглутамин; Hp -3-(4-гидрокснфенил)пропионил; Lys(AzS) - Ме-(4-азидо-салицилоил)лизин; GMDP-Lys([l25[]AzS) - N-ацетилглюкоз-аминил-(р1-4)-1\-ацетилмурамоил^-аланил-0-изоглута-
ми.1-Ые-(3-[1251]-4-азидосалицилоил)лизин; BSA - бычий сывороточный альбумин; PBS - фосфатио-солевой буферный раствор, рН 7.4; MOPS - 3-[1Ч-морфолино]пропансуль-фоновая кислота; PMSF - фенилметилсульфонилфторид; FCS - эмбриональная телячья сыворотка.
* Автор для переписки.
были достаточно противоречивы как в плане самого существования рецепторов мурамоилпептидов, так и относительно их локализации и числа. По данным Силвермана и сотр. [6] мурамоилди-пептидсвязывающие центры локализованы на поверхности макрофагов в количестве не более 500 - 1000 на клетку. В то же время по данным других исследователей [5, 7, 8] рецепторы мурамоилпептидов находятся внутри клеток-мишеней и число их составляет десятки - сотни тысяч [5].
Мы использовали производные GMDP, меченные йодом-125, с целью изучения как поверхностных, так и внутриклеточных GMDP-связываю-щих центров перитонеальных макрофагов мыши. Для установления мембранной или внутриклеточной локализации центров связывания N-аце-тилгл юкозаминсодержащих мурамоилпептидов использовали соответственно нативные и перфорированные клетки.
Первым этапом исследования явилось изучение связывания GMDP с поверхностью перитонеальных макрофагов мыши. Исследование взаимодействия мурамоилпептидов с клетками-мишенями осуществлялось с использованием радиолигандно-го метода анализа, прежде всего из-за его высокой чувствительности. В нашем распоряжении имелось йод-125-меченое производное биологически активного аналога GMDP - GMDP-Lys([125I]Hp) (200 Ки/ммоль), полученное сотрудником лаборатории рецепции нейропептидов ИБХ РАН A.A. Кайдаловым. Оно было синтезировано [9] путем радиоиодирования модифицированного реагентом Болтона-Хантера по е-аминогруппе
ОМОР-Ьув [10]. Для снижения уровня эндоцитоза анализ связывания нативных клеток с лигандами вели при 4°С в присутствии 0.01% азида натрия. За величину специфического связывания прини-
мали разность между значениями общего связывания и неспецифического связывания, измеряемого в присутствии 1000-кратного избытка немеченого СМЕ)Р.
Изучение кинетики связывания ОМЭР-Ьу8(['5з1]Нр) с перитонеальными макрофагами мыши показало, что общее связывание (ЗМОР-Ьу8([1251]Нр) с нативными макрофагами возрастало с увеличением времени инкубации, в то время как специфическое практически не изменялось уже через 5 мин после начала эксперимента (рис. 1).
Специфичность связывания СМОР-Ьук([|251]Нр) с макрофагами подтверждалась данными ингиби-торного анализа. Из рис. 2 видно, что способность конкурировать с ОМВР-Ьу8([1251]Нр) за участки связывания в наибольшей степени была присуща ОМОР и ОМОР-Ьу8. Ингибирующая активность стереоизомера ОМОР с ¿-конфигурацией остатка изоглутамина (Ь-СМЭР) была значительно ниже, что свидетельствует о важности конфигурации этого остатка. Таким образом, наблюдалась корреляция между специфичностью ОМОР-связыва-ющих поверхностных молекул и стереоспеци-фичностью биологической активности глюкоз-аминилмурамошшептидов, поскольку ¿-вМБР биологической активностью не обладает [2].
Построение графика связывания в координатах Скэтчарда позволило определить константу диссоциации лиганд-рецепторпого комплекса и количество участков связывания на клетку (рис. 3). Для нативных макрофагов константа диссоциации составила 350 пМ, а число центров связывания -в пределах 500 -1000 на одну клетку. Полученные результаты согласуются с литературными данными о наличии на плазматической мембране не-
большого числа участков связывания мурамоил-пептидов, причем значения константы диссоциации и максимального связывания практически не отличаются от таковых, полученных в работе Силвермана для мурамоилдипептида [6].
При проведении экспериментов с помощью радиорецепторного анализа был отмечен высокий уровень неспецифической сорбции, что при наличии разброса величин между параллельными пробами обусловило необходимость многократного
2000 -
1000 -
Рис. 1, Зависимость общего (/), специфического (2) и неспецифического (5) связывания СМ1)Р-Ьу.5([ 1]Нр) с нативными перитонеальпыми макрофагами мыши от времени инкубации.
имп/мин
3000 Г
Ингибирование, %
-1-1__-1_I_и_
0 0.01 о.] 1 10 100
Концентрация ингибитора, мк г/мл
Рис. 2. Ингибированне связывания ОМПР-Ьу8([,251]Нр) с нативными макрофагами вМЭР (2) и его аналогами ОМОР-ЬуХ (1) и ЮМОР 0).
Рис. 3. График связывания СМПР-Ьуз([!251]Нр) с нативными макрофагами в координатах Скэтчарда (Всп - доля специфически связанного лиганда, Р - доля свободного лиганда).
повторения экспериментов для получения статистически достоверных результатов.
Функциональное значение мембранных сайтов связывания мурамоилпептидов остается недостаточно изученным. Получено множество данных, демонстрирующих тот факт, что для проявления биологической активности мурамоил-пептиды должны проникнуть внутрь клетки. Об этом свидетельствует усиление макрофагактиви-рующей способности мурамоилпептидов в случае:
1) их инкапсулирования внутрь липосом [7, 11];
2) конъюгации с бычьим сывороточным альбумином, несущим остатки маннозы (наличие у макрофагов маннозоспецифического рецептора позволяет им более эффективно поглощать конъюги-рованный ОМЕ>Р по сравнению со свободным) [12];
3) конъюгации с антимакрофагальными монокло-нальными антителами [13]. Внутриклеточные СМОР-связывающие центры найдены у клеток
миеломоноцитарного ряда, Т-хелперов, клеток нейробластомы [5]. У перитонеальных макрофагов мыши нами было обнаружено 100000 специфических сайтов связывания мурамоилпептидов, причем было показано, что существует по крайней мере два их типа: с константами диссоциации 20 и 540 нМ [5].
С целью предварительной характеристики внутриклеточных вМОР-связывающих молекул макрофагов был использован метод фотоаффинного мечения, позволяющий ковалентно присоединить радиоактивно меченный лиганд к рецептору и в дальнейшем идентифицировать рецеп-торные белки по наличию радиоактивной метки. Для ковалентного связывания С МОР с рецептором было синтезировано радиоактивно меченное производное ОМОР-Ьу8([1251]А28), описанное В.И. Цетлиным с соавт. [19].
Для синтеза фотоактивируемого производного бМИР использовали Г<[-оксисукцинимидный эфир 4-азидосалициловой кислоты. Очистку конъюгата СМОР-Ьув^гЯ) производили методом ВЭЖХ на обращенной фазе. СМОР-Ьуз(АгЗ) элюировался двумя пиками, соответствовавшими двум аномерам дисахаридного остатка СМОР (рис. 4). В результате быстрой интерконверсии аномеров, свойственной СтМОР и его производным [14], при рехроматографии каждого аномера профиль элюции имел двухпиковый характер, аналогичный исходному. Поэтому фракции, соответствующие двум пикам, объединяли и использовали для дальнейшей модификации. На следующей стадии в молекулу СМПР-Ьу8(Ах5) вводили радиоактивный 1251 с использованием хлорамина Т по стандартной методике [9]. Очистку конъюгата также производили методом ВЭЖХ на обращенной фазе (рис. 5).
ОМОР-Ьуч(['251]Аг5) связывался с макрофагами, перфорированными 0.001% дигитонином, причем наблюдалось как специфическое, так и неспецифическое связывание, так как даже при вытеснении немеченым вМИР уровень связывания фотоактивируемого йодпроизводного с клетками оставался очень высоким (до 60%). По всей вероятности, неспецифическое связывание происходит за счет йодазидосалицилоильной группировки. Тем не менее способность фотоактивируемого производного ОМЭР конкурировать за места связывания с исходной молекулой бМОР позволяла использовать его в опытах по ковалентному ме-чению ОМОР-связывающих центров.
После инкубации перфорированных дигитонином перитонеальных макрофагов с ОМЙР-Ьу8([1251]А?.5) в отсутствие или в присутствии избытка немеченого вМПР клетки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.